뇌 발달 장애치료, 태아의 지능 향상 타깃으로 적용 기대
Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells
미래창조과학부(장관 최양희)는 “신경줄기세포*의 분화 운명을 결정하는 뇌 특이 신호네트워킹을 국내 연구진이 처음으로 규명했다”고 밝혔다.
* 신경줄기세포(Neural stem cells) : 신경세포분화(neuronal differentiation)를 통해 신경세포(neuron)으로 분화하기도 하고 성상세포분화(astrocytic differentiation)를 통해 성상세포(astrocyte)로 분화될 수 있는 줄기세포
히포칼신(Hippocalcin)*은 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 칼슘결합단백질로 보고된 이후 현재까지 왜 뇌신경계에만 존재하는지에 대한 이유와 뇌에서 어떤 역할을 하는지는 밝혀지지 않았다. 이번 연구에서 히포칼신이 신경줄기세포의 신경분화* 조절의 새로운 핵심단백질로 관여한다는 사실이 밝혀졌다.
* 히포칼신 : recoverin family중의 하나인 칼슘결합 단백질, 해마(hippocampus)를 포함한 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 단백질
* 신경분화 : 신경줄기세포가 신경세포(뉴런, neuron) 나 신경아교세포(glial cell)로 분화하는 현상
한중수 교수 연구팀(한양대)은 미래창조과학부 기초연구사업(집단연구)의 지원으로 연구를 수행했으며, 이 연구는 국제 학술지 스템 셀 리포트(Stem Cell Reports) 12월 22일자에 온라인 게재되었다.
o 논문명과 저자 정보는 다음과 같다.
- 논문명 : Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells
- 저자 정보 : 한중수 교수 (교신저자, 한양대학교 의과대학) 박신영 박사 (제1저자, 한양대학교 의생명연구원)
□ 논문의 주요 내용은 다음과 같다.
1. 연구의 필요성
신경줄기세포를 이용한 새로운 치료법의 개발을 위해서는 신경줄기세포의 분화에 대한 분자생물학적 조절 메커니즘에 대한 연구가 필수이다. 특히 특정 자극에 반응하여 분화의 운명이 결정되는 줄기세포의 분화조절 메커니즘 규명은 신경세포로의 분화유도와 발달단계의 조절에 반드시 선행되어야 할 연구이다.
히포칼신은 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 칼슘결합단백질로 보고된 이후 현재까지 왜 뇌신경계에만 존재하는지, 뇌에서 어떤 역할을 하는지 밝혀지지 않았다.
2. 연구 내용
임신 14일 된 흰쥐의 배아 (E14)에서 분리한 대뇌피질 신경줄기세포를 대상으로 분화 유도 시 히포칼신이 신경세포분화 (neuronal differentiation)를 유도하고 반면 성상세포분화 (astrocytic differentiation)를 억제한다는 사실을 규명하였다.
* 성상세포 (astrocyte) : 신경세포(neuron)을 물리적으로 지지하고 세포간질액의 이온농도를 유지하도록 돕는 중추신경계 세포
연구팀은 신경줄기세포의 분화 유도 시 칼슘(Ca2+)과 결합한 히포칼신은 PKC-α*와 결합하여 세포막으로 이동 후 PDK-1*과 복합체를 이루며 PKC-α를 활성화시킴을 확인하였다. 이렇게 활성화된 PKC-α는 세포막에 존재하는 PLD1* 활성을 증가시켰다. 신경줄기세포에 PLD1을 siRNA*처리로 발현을 저하시킨 결과, 신경줄기세포의 신경분화가 억제됨과 동시에 성상세포로의 분화가 증가한다는 것을 확인함으로써 PLD1이 신경분화조절에 관여하고 있는 중요한 지능인자임을 규명하였다.
* PKC-α : 특정 단백질의 인산화를 유도하는 인산화효소의 일종
* PDX-1 : 특정 단백질의 인산화를 유도하는 인산화효소의 일종
* PLD1 : 인지질 분해 효소 중 한 가지 유형으로 세포막의 특정인지질을 분해하는 효소
* siRNA : small interfering RNA의 약자로 특정한 유전자의 발현을 억제시키는 RNA
전사인자 STAT3*(Tyr705)의 돌연변이(mutant) 실험 결과, STAT3 (Tyr705)의 탈 인산화에 의해 신경줄기세포의 신경세포분화가 증가되었다. 또한 STAT3 (Tyr705)의 탈 인산화는 SHP-1*에 의해 조절된다는 것을 알 수 있었고, 이 SHP-1의 활성은 바로 PLD1의 활성 산물인 PA*에 의해 조절된다는 중요한 결과를 도출하였다. 신경줄기세포에 SHP-1의 발현을 억제시켰을 때 신경줄기세포의 신경세포분화가 억제됨과 동시에 성상세포분화가 증가하였다.
* STAT3 : 인산화에 의해 활성이 조절되는 전사인자의 일종으로 특정 단백질의 발현을 조절함.
* SHP-1 : 탈 인산화효소의 일종으로 인산화된 단백질에서 인산기를 제거하는 효소
* PA : 세포 내 신호전달의 2차 전령자로 작용하는 인지질로서 phosphatidic acid의 약자임.
3. 연구 성과
이 연구는 신경줄기세포 분화에서 히포칼신이 신경세포분화를 증가시키는 반면 성상세포분화는 억제시킨다는 신호네트워킹을 세계 최초로 규명하였다. 새롭게 규명된 이 신호네트워킹은 신경줄기세포가 안정적으로 신경세포로 분화할 수 있게 해줌으로써 뇌 발달과 지능획득에 중요하게 작용하였다.
신경계에만 존재하는 칼슘결합 단백질인 히포칼신에 의한 신경세포로의 분화유도 메커니즘이 확립됨으로써 뇌 발달 장애 질환 및 지능향상의 세포 치료 타깃으로의 응용이 기대된다.
한중수 교수는 “이 연구는 신경줄기세포가 성상세포를 포함한 신경아교세포*로 분화되지 않고 신경세포(뉴런)로 안정적으로 분화하도록 하는 뇌 특이 신호네트워킹을 최초로 밝힌 것이다. 지능유전자인 PLD1* 활성화에 뇌신경계에서만 발현되는 히포칼신이 핵심 단백질로 작용하였다. 앞으로 뇌 발달 장애치료 및 태아의 지능향상을 위한 타깃으로 응용될 것으로 기대된다”라고 연구의 의의를 설명했다.
*신경아교세포 : 신경세포에 영양물질의 공급, 신경전달이 이루어지도록 하는 세포외액의 조절, 신경 세포의 면역작용 등의 다양한 역할을 한다. 뇌 속에 가장 많이 분포되어 있으며, 크기는 신경세포의 1/10 정도다.
연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
신경줄기세포를 이용한 새로운 치료법의 개발을 위해서는 신경줄기세포의 분화에 대한 분자생물학적 조절기전에 대한 연구가 필수적이며, 특히 특정 자극에 반응하여 분화의 운명이 결정되는 줄기세포의 분화조절 메커니즘의 규명은 신경세포로의 분화유도와 발달단계의 조절에 반드시 선행되어야 할 연구다.
현재까지 대부분의 신경줄기세포의 분화와 관련된 기존의 연구방향은 특정유전자의 과 발현 및 억제를 통해 신경줄기세포에서 주로 신경세포(Neuron)기능의 조절여부를 확인하였다.
히포칼신은 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 칼슘결합단백질로 보고된 이후 현재까지 왜 뇌신경계에만 존재하는 지에 대한 이유와 뇌에서 어떤 역할을 하는지 아직 확실하게 밝혀지지 않았다.
2. 연구내용
ㅇ 신경줄기세포의 신경세포분화에서 히포칼신의 중요성 확인
뉴로트로핀*(NT3, NT4/5, BDNF)의 발현 및 신경돌기 성장*(neurite outgrowth)과 신경세포의 비율이 히포칼신의 과발현으로 인해 현저히 증가함을 밝혔다. 신경줄기세포의 히포칼신 발현을 억제시키면 신경세포로의 분화가 억제됨을 확인할 수 있었으며, 반대로 성상세포로의 분화가 증가됨을 확인하였다. 이를 토대로 대뇌피질의 신경줄기세포의 분화에 있어서 히포칼신은 신경세포분화 (neuronal differentiation)를 유도하고 성상세포분화 (astrocytic differentiation)를 억제하는 중요한 물질임을 규명하였다.
*뉴로트로핀(neurotrophin) : 신경세포의 성장을 촉진하는 단백질 군
*신경돌기 성장 : Axon 과 dendrite와 같은 신경 돌기의 성장으로 신경회로 형성에 중요하게 관여함.
ㅇ 신경줄기세포의 신경세포분화과정에 미리스토일화*된 히포칼신과 칼슘의 결합이 필수임을 확인
히포칼신은 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 단백질로 칼슘 결합 부위가 존재하며 아미노 말단에 미리스토일화되는 부위가 있다. 이 연구에서 신경줄기세포의 분화를 유도하면 세포내의 칼슘이 증가함을 확인하였으며, 이 때 미리스토일화된 히포칼신은 칼슘과 결합한 뒤 세포막으로 이동하여 PKC-α를 활성화시켜 신경세포로의 분화를 촉진한다는 것을 밝혔다.
*미리스토일화 (myristoylation) : 지방산의 일종인 미리스틴산에 의한 단백질의 수식반응으로써 미리스토일 전이효소가 N말단부위의 공통배열을 인식하여 미리스토일 CoA에서 N말단글리신의 아미노기에 미리스토일기(C14:0)를 전이하여 아미드결합을 형성하는 과정
ㅇ신경줄기세포에서 신경세포분화를 조절하는 히포칼신-매개 신호전달메커니즘 규명
신경줄기세포의 분화 유도 시 칼슘과 결합한 히포칼신은 PKC-α와 결합하여 세포막으로 이동한 후 PDK-1과 복합체를 이루며 PKC-α가 활성화됨을 확인하였다. 이렇게 활성화된 PKC-α는 세포막에 존재하는 PLD1 활성을 증가시켰다. 신경줄기세포에 siRNA로 PLD1의 발현을 억제시킨 결과 신경줄기세포의 신경분화가 억제됨과 동시에 성상세포로의 분화가 증가한다는 것을 확인함으로써 PLD1이 신경분화조절에 관여하고 있는 중요한 지능인자임을 규명하였다.
ㅇ 신경줄기세포의 신경세포분화를 조절하는 전사인자 활성 메커니즘 규명
전사인자 STAT3 (Tyr705)의 돌연변이실험을 통해 STAT3 (Tyr705)의 탈 인산화가 신경줄기세포의 신경세포분화를 증가시킴을 확인하였다. 또한 STAT3 (Tyr705)의 탈 인산화는 SHP-1이란 탈인산효소에 의해 조절된다는 것을 알 수 있었고, 이 SHP-1의 활성은 바로 PLD1의 활성 산물인 PA에 의해 조절된다는 중요한 결과를 도출하였다. 신경줄기세포의 SHP-1 발현을 억제시켰을 때 신경세포분화가 억제됨과 동시에 성상세포분화가 증가함을 확인하였다.
ㅇ 결론적으로 이 연구에서는 신경줄기세포 분화시 칼슘과 결합한 히포칼신이 PKC-α를 활성화 시킨 뒤 PLD1/PA/SHP-1 경로를 통해 STAT3(Tyr705)의 탈 인산화를 유도함으로써 신경세포분화를 증가시키는 반면 성상세포분화는 억제시킨다는 신호네트워킹을 최초로 규명함. 연구자들에 의해 규명된 이 신호네트워킹은 신경줄기세포가 안정적으로 신경세포로 분화할 수 있게 해줌으로써 뇌 발달과 지능획득에 중요하게 작용하였다.
3. 기대효과
이 연구를 통해 도출된 신경줄기세포 분화 메커니즘은 신경세포와 성상세포 분화의 다양한 메커니즘을 설명할 수 있는 기본지식의 틀을 제공하게 될 것이다. 이러한 지식들은 기초 신경 생물학의 새로운 근간이 될 수 있을 뿐만 아니라 신경줄기세포에서 여러 종류의 신호전달과 관계된 유전자들의 역할을 알아낼 수 있을 것이며, 더 나아가 신경계 뇌 발달 장애와 관련된 여러 질병들의 발병원인들을 분자생물학적으로 이해하는 데 중요한 정보를 제공하게 될 것이다.
더 나아가 신경계에만 존재하는 칼슘결합 단백질인 히포칼신에 의한 신경세포로의 분화유도 메커니즘이 확립됨으로써 뇌 발달 장애 질환 치료 및 지능향상의 세포치료 타깃으로의 응용이 기대된다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
기억을 포함한 지능의 분자생화학적 메커니즘이 무엇일까에 대한 의학자로서의 호기심이 출발점이다. 본 연구자는 지난 20여년간 phospholipase D (PLD) 시그널링 연구에만 전념해 왔다. 지능과 연계된 뇌발달에는 여러 가지 복잡한 요인들이 관여하나 크게 두 가지 즉, 신경세포(neuron)의 population 유지와 신경돌기 성장(엑손과 덴드라이트의 성장)을 통한 신경회로의 완성이 중요하게 작용한다. 본 연구자는 PLD1이 신경돌기 성장을 통한 신경회로 형성에 있어 핵심 지능 단백질로 작용함을 밝혀 이에 대한 연구결과를 계속 발표해 왔다(2005,2006,BBRC; 2007,JCB; 2012,BJ; 2012,2015 Mol.Neurobiol). 또한 본 연구자에 의해 PLD1활성화에 관여한다고 보고된(2000,Mol.Cells; 2006,JCB) 히포칼신은 특이하게도 뇌 신경계에서만 발현된다. 이런 이유로 히포칼신이 뇌 신경세포에서 중요한 역할을 할 것이다라는 가설을 세우게 되었고, 실제로 신경세포주를 대상으로한 이전 연구에서 신경분화과정에 중요하게 작용함을 세계 최초로 보고된 바 있다(2008,JNR). 이러한 연구결과를 토대로, 신경줄기세포에서도 일반 신경세포주에서 규명된 히포칼신의 기능을 재현할 수 있다면 뇌 기능의 발달조절을 이해하는 데 있어 중요한 연구가 될 것이라는 전제하에 이 연구를 좀 더 심도 있게 진행하게 되었다.
□ 연구 전개과정에 대한 소개
임신 14일 된 흰쥐의 태아로부터 분리한 대뇌피질 신경줄기세포에 히포칼신 유전자를 과발현 시킨 결과, 신경영양성인자 (Neurotrophic factors) 들의 발현과 신경세포 (neuron)의 수가 현저히 증가한다는 것을 알 수 있었다. 또한 흥미롭게도, 히포칼신에 의해 신경줄기세포의 분화 시 신경세포의 수가 증가한 반면 성상세포 (astrocyte)의 수는 억제됨을 확인하였다. 반대로 히포칼신 유전자를 억제하였을 때 신경세포의 수는 줄어들고 성상세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 신경줄기세포의 분화 시 증가된 칼슘농도가 히포칼신의 활성화에 필수적이며, 칼슘과 결합한 히포칼신이 PKCα를 세포막으로 유도하며 활성화 시켜 PLD1/PA/SHP-1의 신호전달과정을 통해 전사인자 STAT3(Tyr705)의 탈 인산화를 유도함으로써 신경세포로의 분화를 증가시킨다는 결과를 도출하게 되었다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
신경줄기세포에서 히포칼신이 신경세포를 증가시키고 성상세포를 억제하는데 있어 전사인자 STAT3 (Tyr705)의 탈인산화가 관여하고 있음을 확인했지만, 탈인산화의 세부기전을 알아내는 데 어려움을 겪고 있을 때, 박신영 박사가 탈인산화효소인 SHP-1의 활성기전과 여러 분자생물학적 실험을 뒷받침 해 주어 본 연구를 추진해 나갈 수 있었다. 또한, 신경줄기세포 특성상 유전자 발현의 효율이 일반 세포보다 훨씬 떨어져 실험의 정확성과 재현성을 확신하기 힘들었지만, 지속적인 실험 방법의 관찰 및 수정의 노력 끝에 안정적인 연구결과를 이끌어 낼 수 있었다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
신경줄기세포는 신경계통 세포로의 분화능을 가졌기 때문에 신경 세포 (neuron), 성상세포 (astrocyte), 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)로 분화된다. 대부분의 신경줄기세포의 분화와 관련된 기존의 연구방향은 특정 유전자의 조절을 통해 하나의 특정 세포로의 조절 여부가 관심인 반면, 본 연구에서는 신경줄기세포에서 히포칼신이 신경세포로의 분화를 촉진하며, 동시에 성상세포로의 분화를 억제하는 스위치 단백질로서의 역할을 규명해 냈다는 것이 큰 성과이다. 즉 히포칼신이라는 뇌 특이 칼슘결합단백질이 PLD1과 네트워킹을 형성하여 신경줄기세포를 신경세포로 안정적으로 분화시켜 신경세포의 population을 증가시킴으로써 지능과 연계된 뇌발달에 관여한다는 중요한 팩트를 제시했다는 것이 중요한 의미가 있다. 본 연구를 심사한 세계적 잡지인 Cell의 파트너 잡지 Stem Cell Reports의 리뷰어들도 이 연구결과의 독창성과 중요성을 높이 평가하여 게재를 승인하였다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표와 향후 연구계획은?
본 연구진은 같은 단백질이라도 세포가 어떠한 상황에 놓여 있는지에 따라 전혀 다른 기능을 할 수 있다고 생각한다. 특히 태아의 뇌 발달은 단계에 따라 무궁무진한 변화가 일어나기 때문에, 본 연구진은 뇌의 각 발달단계에 따른 세포분화조절에 히포칼신이 어떻게 관여하고 있는지에 대해 새로운 연구를 진행하고 있다. 궁극적으로는 뇌에서 히포칼신의 조절을 통한 신경세포기능제어 가능성을 규명하고 나아가 뇌 질환의 핵심 치료목적 단백질로서의 가능성을 도출할 수 있기를 기대해본다.
□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?
히포칼신의 다양한 유전자 재조합 돌연변이들을 만들기 위해 6개월이라는 시간이 걸렸는데, 알고 보니 처음부터 잘못된 단백질 도메인 정보를 갖고 시작했음을 알아차리고 그 동안 만들었던 유전자 재조합 돌연변이들을 안타까운 마음으로 버리게 된 일이 있었다. 그 후 정확한 정보를 바탕으로 다시금 공들여 우리가 원하는 유전자 재조합 돌연변이들을 모두 만들어 실험에 도입했던 그 감격스런 순간이 가장 기억에 남는다. 모든 실험은 시행착오 속에서 배양된다. 실패가 없으면 성공도 없다.
용 어 설 명
1. 히포칼신 (Hippocalcin)
○ recoverin family중의 하나인 칼슘결합 단백질, 해마(hippocampus)를 포함한 뇌신경계에서만 특이적으로 발현되는 단백질이다.
2. 신경줄기세포 (Neural stem cells)
○ 신경세포분화(neuronal differentiation)를 통해 신경세포(neuron)으로 분화하기도 하고 성상아교세포분화(astrocytic differentiation)를 통해 성상아교세포(astrocyte)로 분화될 수 있는 줄기세포이다.
3. 신경세포 (Neuron)
○ 신경계를 구성하는 주된 세포이며, 서로 인접한 신경세포와 시냅스라는 구조를 통해 신호를 주고 받음으로써 다양한 정보를 받아들이고, 저장하는 기능을 한다.
4. 성상세포 (Astrocyte)
○ 세포체에 뻗어 있는 많은 돌기 때문에 별처럼 보이는 신경 아교 세포로 신경세포의 생리적 기능을 지지하고, 신경세포가 기능을 수행하는데 필요한 화학물질을 생성한다.
5. 신경아교세포 (Glial cells)
○ 뇌 속에 가장 많이 분포되어 있으며, 크기는 신경세포의 1/10 정도이다. 형태에 따라서 희소돌기아교세포(oligodendroglia), 성상세포 (astrocyte), 미세아교세포(microglia)로 나뉜다. 신경세포에 영양물질의 공급, 신경전달이 이루어지도록 하는 세포외액의 조절, 신경 세포의 면역작용 등의 다양한 역할을 한다.
6. PLD (phospholipase D)
○ 세포막에 존재하는 인지질 가수분해 효소로써 phosphatidic acid(PA)-매개 세포 신호전달에 관여한다.
○ 뇌 발달과정에서는 지능 유전자로 작동하며 기타 기관에서는 암과 염증 및 각종 분화과정을 조절하는 신호전달 단백질로 작용한다.
7. 미리스토일화(Myristoylation)
○ 지방산의 일종인 미리스틴산에 의한 단백질의 수식반응으로써 미리스토일 전이효소가 N말단부위의 공통배열을 인식하여 미리스토일 CoA에서 N말단글리신의 아미노기에 미리스토일기(C14:0)를 전이하여 아미드결합을 형성하는 것을 의미한다.
8. 신경돌기 성장(Neurite outgrowth)
○ 신경 축삭돌기의 성장을 의미한다. Axon과 dendrite를 포함하며 신경회로 형성에 관여한다.
그 림 설 명
(그림 1) 히포칼신(Hpca) 유전자 발현이 신경세포의 분화에 미치는 영향
A) 신경줄기세포에 히포칼신 유전자를 발현시킨 후 3일 동안 분화를 유도한 뒤 신경세포의 분화 정도를 비교한 결과 히포칼신 유전자를 발현시킨 신경줄기세포 (맨 오른쪽)가 분화만 유도된 신경줄기세포(가운데) 보다 신경세포의 분화가 현저히 증가함을 확인하였다.
B, C) 실험결과를 그래프로 나타낸 결과이다. 신경돌기 길이(Neurite length)와 신경세포마커(TUJ1+) 세포가 히포칼신 유전자를 발현시키면 유의하게 증가함을 확인하였다.
(그림 2) 히포칼신(Hpca) 매개 신호전달물질들이 신경분화에 미치는 영향
A) 신경줄기세포에 히포칼신 또는 Pld1 유전자를 억제시킨 결과 신경세포의 수가 줄어들고, 성상세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다.
B) A)의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
C) 신경줄기세포에 Shp-1 유전자를 억제시키면 STAT3(Y705)의 탈인산화가 억제됨을 확인하였다.
D) STAT3(Y705)의 활성을 억제하는 돌연변이 유전자 (STAT3YF)가 발현되면 일반 STAT3(WT) 유전자에 비해 신경세포의 수가 유의성 있게 증가하며, 성상세포의 수는 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. E) D)의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
(그림 3) 연구결과 개요
신경줄기세포의 분화 유도시 칼슘과 결합한 히포칼신은 PKC-α와 결합하여 세포막으로 이동한 후 PDK-1과 복합체를 이루며 이를 통해 PKC-α를 활성화 시킨다. 활성화된 PKC-α는 PLD1/PA/SHP-1 의 신호전달과정을 통해 STAT3(Tyr705)의 탈 인산화를 유도함으로써 신경세포분화를 증가시키는 반면 성상세포로의 분화는 억제시킨다.
