베타카테닌과 라스 단백질 이중표적 대장암 치료제 상용화 길 열려
Nature Chemical Biology에 6월 14일 온라인판에 게재
Small molecule binding of the Axin-RGS domain promotes β-catenin and Ras degradation
미래창조과학부(장관 최양희)는 암을 유발하는 대표적인 인자인 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하여 암세포를 억제하는 혁신형 저분자 화합물 대장암 치료제를 개발하였다고 밝혔다.
이 발암물질들을 제어할 수 있는 항암제를 개발하려는 시도는 많았으나 실제 임상에서 사용 가능한 항암제는 없는 실정이다.
특히 라스는 대표적 발암 유전자이나 항암제 개발을 위한 많은 시도가 실패한 상황이다.
최강열 교수팀(연세대학교)이 주도한 이번 연구는 미래창조과학부 기초연구사업(집단연구)의 지원을 받아 진행되었고 이번 연구 결과는 화학생물학 분야의 저명한 학술지‘네이처 케미컬 바이올로지 (Nature Chemical Biology)’에 6월 14일 온라인판에 게재되었다.
o 논문명과 저자 정보는 다음과 같다.
- 논문명 : Small molecule binding of the Axin-RGS domain promotes β-catenin and Ras degradation
- 저자 정보 : 최강열 교수(교신저자, 연세대), 한균희 교수(연세대), 이원태 교수(연세대), 민도식 (부산대), 차부현 박사(제1저자, 연세대)
□ 논문의 주요 내용은 다음과 같다.
1. 연구의 필요성
대장암은 높은 빈도로 발병하는 암으로 현대사회의 암 사망원인의 주요 원인으로 꼽히고 있다. 현재 사용 중인 치료제들은 지속적 사용에 따라 내성과 저항성을 보여 이를 극복하기 위한 효과적 치료법의 개발이 요구되고 있다.
대장암은 APC*와 KRas** 돌연변이를 포함한 유전적 변이에 의해서 발생 하는데, 이들 돌연변이로 인해 많은 암환자들에게서 윈트/베타카테닌 및 라스 신호전달체계***의 비정상적인 활성화가 관찰된다.
* APC : 윈트신호전달계를 저해하는 암 억제 인자로 기능 소실시 대장암 발생에 중요 원인
** KRas : NRas, HRas 등을 포함하는 Ras의 한 종류로 각종 암에서 유전자 돌연변이가 30-40%의 높은 빈도로 발생되며, 돌연변이 시 암의 중요 원인
*** 라스신호전달계(Ras signaling) : 세포성장/분화 등을 조절하는 주요 신호전달계로서, 라스 및 본 신호전달계의 관련 단백질의 돌연변이로 인해 대부분의 암에서 과활성 되어 있음. 따라서 주요한 항암제 개발 타겟 중 하나임.
이에 따라 두 신호전달체계를 동시 제어 치료법은 암의 치료에 이상적일 것으로 제안되었다. 그러나 이들 신호전달체계 조절 메커니즘에 대한 연구가 거의 없는 실정이기 때문에, 신호전달계 제어 치료제는 개발되지 않고 있다.
2. 연구 내용
선행연구를 통해 윈트/베타카테닌 신호전달계의 신호전달 억제를 통해서 라스 단백질이 분해될 수 있음을 규명하였다. 이를 바탕으로 저분자 화합물 라이브러리를 검색하여 윈트/베타카테닌 신호전달계 억제를 통한 베타카테닌과 라스 단백질을 동시 분해 가능한 화합물을 발굴하였다.
또한 유도체 합성을 통해 발굴한 물질보다 물성 및 효능이 증진된 화합물 (KYA1797K)을 확보하고, 동 화합물이 돌연변이를 가진 다양한 대장암 세포의 성장 및 변화(transformation)를 억제함을 세포 수준 및 동물실험 수준에서 확인하였다.
또한 이 화합물이 실험용 쥐에 이종 이식된 대장암과 유전자 돌연변이로 인해 발생한 암의 성장을 크게 억제함을 복강 투여로 확인 하고, 해당 화합물이 베타카테닌과 라스 단백질을 분해하는 약물조절 메커니즘을 규명하였다.
이번 연구는 베타카테닌과 라스 단백질의 분해를 통해서 돌연변이나 각종 원인에 의해서 윈트/ 베타카테닌 및 라스 신호전달체계가 활성화 되어있는 대장암 및 다양한 다른 종류의 암을 치료할 수 있는 새로운 저분자 화합물적 접근 방법을 제시하고 있다.
3. 연구 성과
윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계는 다국적 제약회사들이 두 신호전달계를 제어할 수 있는 항암제를 개발하려고 시도해 왔지만 현재까지 임상에서 사용되고 있는 두 신호전달계를 제어하는 항암제는 없는 실정이다.
특히 라스는 모든 암에서 30~40% 이상의 돌연변이가 발견되는 대표적 발암 유전자이나 항암제 개발을 위한 많은 시도가 실패한 상황이다.
이번 연구의 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 저분자 화합물 및 치료 전략은 대장암을 비롯한 신호 전달계가 과활성화 되어있는 다양한 암에 적용할 수 있는 다중표적 항암제 개발에 적용할 수 있다. 또한 라스를 제어하는 항암제 개발에 신규 전략이 될 수 있을 것으로 기대된다.
최강열 교수는“베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 것이 윈트/베타카테닌 및 라스 신호전달체계가 과활성화 되어있는 대장암과 다양한 암을 치료하는 다중표적 항암제 개발의 새로운 전략임을 보여주었고, 특히 라스 치료용 혁신형 항암제*의 개발 가능성을 제시하였다”고 밝혔다.
* 혁신형 항암제(퍼스트 인 클래스(first-in-class) 약물) : 기능이 새롭게 알려진 단백질을 그 작용대상으로 하는 최초의 약물
연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
대장암은 높은 빈도로 발병하는 암 종의 하나로서 서구에서는 암과 관련된 사망원인의 주요원인으로 꼽히고 있다. 대장암 치료를 위해서 화학치료요법과 분자표적치료가 사용되고 있으나, 종종 효능이 짧게 지속되거나 유전적 돌연변이로 인해서 약물에 대한 저항성이 발생 하는 등의 문제점이 나타타고 있다. 따라서 대장암을 치료할 수 있는 효과적인 치료법의 개발이 요구되고 있다.
대장암은 APC와 Kras 돌연변이를 포함한 복합적이고 순차적인 유전적 변이에 의해서 발생하는데, APC와 Kras 돌연변이는 각각 윈트/베타카테닌 및 라스 신호전달체계의 비정상적인 활성화를 이끌어낸다. APC 돌연변이는 90% 이상의 대장암 환자에서 발견되고 대부분의 대장암의 시작을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
발암성 Kras 돌연변이는 약 32-57%의 대장암 환자에서 발견되고 이는 대장암의 진행을 유도한다. 기존의 연구들은 대장암의 형성 및 성장에서 라스 신호전달체계와 윈트/베타카테닌 신호전달계가 강하게 연관되어 있음을 보여주고 있다. Kras 단독 돌연변이는 대장의 상피조직의 악성변화(malignant transformation)를 유도하지 못하지만, APC 돌연변이 후의 Kras 돌연변이 발생은 암화와 침투적인 성격을 강화시키는 것으로 알려져 있다.
APC와 Kras 돌연변이의 높은 발생 비율과 상호관계를 바탕으로, 윈트/베타카테닌 및 라스 신호전달체계를 동시에 제어 하는 치료법이 대장암 치료에 이상적일 것으로 제안되었다. 그러나 이들 신호전달계를 조절하는 기전 연구가 거의 되어 있지 않기 때문에, 이 신호전달계를 제어하는 치료제는 개발되지 않은 실정이다.
2. 연구내용
연구배경에서 연구내용으로 최근에 본 연구진은 윈트/베타카테닌 신호전달계의 음성 조절자인 APC, 액신(Axin), glycogen synthase kinase 3β(GSK3β)를 통한 본 신호전달계의 억제를 통해서 라스 단백질이 분해될 수 있음을 규명하였다. 윈트/베타카테닌 신호전달계가 음성적으로 조절되었을 때, 베타카테닌과 라스 단백질은 함께 분해되었다. 라스 단백질은 GSK3β에 의해 인산화되고 β-TrCP E3 linker가 참여하여 프로테암좀 분해를 거친다.
베타카테닌과 라스 단백질은 대장암에서 자주 증가되어 있는데 특히 암줄기세포가 연관된 전이성 대장암에서 그러하다. APC 돌연변이에 의한 베타카테닌과 라스 단백질 증가는 APC와 Kras 돌연변이와 관련된 암 성장의 상승작용에 원인으로 여겨진다. 이를 바탕으로 본 연구진은 윈트/베타카테닌 신호전달계 억제를 통한 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해할 수 있는 화합물을 발굴하기 위해서 저분자화합물 라이브러리를 검색하였다.
KY1220 화합물을 발굴하고 동 대학의 한균희 교수와의 공동연구를 통해 효능이 개량된 유도체인 KYA1797K을 확보하였다. 이 화합물들은 베타카테닌과 라스 단백질을 분해하였고, APC와 Kras 돌연변이를 가지고 있는 다양한 대장암 세포의 성장 및 변화(transformation)를 감소시켰다. 같은 대학의 이원태 교수와의 핵자기공명 적정(NMR titration) 실험 등을 통해서 KYA1797K가 액신(axin)의 regulators of the G-protein signaling(RGS) 도메인에 직접 결합한다는 것을 규명하였다.
KYA1797K는 베타카테닌 파괴 콤플렉스(β-catenin destruction complex) 형성을 촉진하고 GSK3β활성화를 유도하여 베타카테닌의 S33/S37/T41와 K-Ras의 T144/148부위의 인산화를 이끌어냄을 확인하였다. 인산화된 베타카테닌과 KRas는β-TrCP E3 linker가 관련된 폴리유비퀴틴화 의존적인 프로테아좀 분해 과정을 통해 분해되었다.
베타카테닌과 라스 단백질의 분해에 있어서 GSK3β가 주요한 역할을 함은 GSK3β가 삭제된 마우스 배아 섬유아세포, KYA1797K와 결합을 못하는 액신 돌연변이, GSK3β에 의해 인산화 되는 T144/148부위가 변이된 KRas를 이용한 실험을 통해 보여주었다. 마지막으로 KYA179K가 APC와 Kras 돌연변이를 가진 대장암 세포가 이종이식된 마우스 모델과 Apcmin/+/KrasG12DLA2 마우스 모델의 암의 성장 및 진행을 효과적으로 억제함을 보여주었다.
본 연구는 베타카테닌과 라스 단백질의 저해를 통해서 윈트/베타카테닌 및 라스 신호전달체계가 활성화 되어있는 대장암 및 다른 종류의 암을 치료할 수 있는 새로운 저분자 화합물적 접근법을 제시하고 있다. 또한 액신을 본 화합물의 타겟단백질로 규명하고 베타카테닌 파괴 콤플렉스의 조절을 통한 GSK3β 활성화가 관련된 약물조절기전을 규명하였다.
3. 기대효과
암은 하나의 결함이 아니 복합적인 유전적/분자적 이상에 의해 유발되는 질병이다. 하나의 타겟 또는 신호전달계를 저해하는 항암제들은 그것들을 보상하기 위한 복합적 신호전달계 동시적인 조절 등에 의해서 자주 내성을 보이거나 약효가 감소하는 현상이 나타난다.
윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계는 대장암을 비롯한 다양한 암의 발생 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 오랫동안 다국적 제약회사들이 두 신호전달계를 제어할 수 있는 항암제를 개발하려고 시도해왔다. 하지만 현재까지 임상에서 사용되고 있는 두 신호전달계를 제어하는 항암제는 없는 실정이다. 따라서 본 연구진이 개발한 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 저분자화합물 및 치료전략은 대장암을 비롯한 윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계가 과활성화 되어 다양한 암종에 적용할 수 있는 다중표적 항암제 개발 전략으로서 적용할 수 있다.
특히 라스는 모든 암에서 30% 이상의 돌연변이가 발견되는 대표적인 발암유전자이며, Kras 돌연변이를 가진 환자의 경우 세툭시맙(cetuximab) 같은 EGFR 항체 항암제를 포함하는 차세대 항암제에 저항성을 갖는 것이 잘 알려져 라스는 여전히 가장 매력적인 항암제 타겟으로 남아 있다.
미국 국립암센터(NCI)의 원장이며 노벨상 수상자인 Herold E. Vamus 박사는 2013년 가을 미국암학회(AACR)회장을 최근 역임한 Frank McCormick 교수를 영입하여 라스제어 항암제 개발을 목표로 하는 새로운 “메가 라스 프로젝트”를 발주하여 매년 10억 달러의 연구비를 투여하며 라스제어 항암제 개발에 강한 의지를 표명 한 바가 있다.
그 동안의 연구는 라스의 활성을 제어하려는 시도가 대부분이었으나 낮은 효능 및 독성으로 인해 실패한 상황이고, 최근에 작은 저해 RNA(siRNA) 등을 이용한 RAS의 양을 낮추려는 시도가 이루어지고 있으나, 물질의 전달 및 특이성 때문에 현재로는 개발이 제한되어 있는 상황이다.
본 연구진이 이번 연구를 통해서 규명한 윈트/베타카테닌 신호 전달계를 통하여 라스단백질 안정성을 조절하는 다중표적 항암제의 경우는 아직 보고된 사례가 없고 본 연구진의 연구가 선도적 역할을 수행하고 있다. 본 연구에서 개발한 저분자화합물이 동물모델에서도 탁월한 항암효과를 보임으로써 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 물질 및 물질개발전략이 비정상적으로 윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계가 과발현 되어 있는 대장암을 비롯한 다양한 암을 치료할 수 있는 항암제 개발에 신규 치료 전략이 될 수 있을 것으로 기대된다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
본 연구진은 최근 10년간의 연구를 통해서 암 발생과 관련하여 가장 중요한 인자중의 하나인 라스가 윈트/베타카테닌 신호전달계 조절에 의해서 지금까지 알려지지 않은 단백질 분해 수준에서 조절됨을 최초로 규명했었다. 이러한 선행 연구를 바탕으로 윈트/베타카테닌 신호전달계 억제를 통해서 라스 단백질을 분해하여 제거하는 항암제 개발 가능성을 알게 되었고, 실제 본 연구를 통해서 이 같은 저분자화합물을 발굴하는 연구를 시작하게 되었다.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
연구진의 선행연구를 통해서 윈트/베타카테닌 신호전달계 억제를 통해서 라스 단백질 분해를 유도하는 화합물을 찾기 위해 화합물 라이브러리를 대상으로 화합물검색을 수행하였다. 이러한 검색을 통해 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 저분자 화합물을 발굴하였고 다양한 대장암 세포주의 성장 및 균체형성을 억제하는 것을 확인하였다. 연세대학교 생명공학과 한균희 교수님과의 공동연구를 통해 효능과 물성이 개량된 물질을 확보하였고, 윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계가 과활성화 되어 있는 대장암 세포의 성장 뿐만 아니라 2가지 동물모델을 이용하여 암의 형성 및 진행을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한 본 화합물이 axin-RGS 도메인에 결합하여 베타카테닌 파괴 단백질복합체 형성을 촉진하고 GSK3β 활성화를 통해 베타카테닌과 라스 분해하는 기전을 규명하였다. 연세대학교 생화학과 이원태 교수님과의 공동연구를 통해 단백질-화합물 결합구조 분석을 수행 했고, 이 결과를 통해 개발한 화합물과 axin-RGS 도메인과의 결합을 구조적를 좀더 명확하게 규명 하였고, 연구를 잘 마무리할 수 있었다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
본 연구는 단순한 생물학적 연구만으로는 완성 할 수 없는 광범위한 성격의 연구로 임상 의사를 통한 환자샘플 확보, 의약화학 전문가인 한균희 교수님과의 공동연구를 통한 화합물 유도체 합성, 또한 구조생물학자인 이원태 교수님의 단백질-저분자 화합물의 규종 규명 등 연구의 조율이 매우 중요했고 상호 적극적인 협력 하에 연구를 잘 마무리 할 수 있었다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
라스단백질 제어 항암제의 경우 현재 개발 한계가 있음이 알려 져 있으나, 현재 사용되고 있는 중요 표적항암제 들이 환자들이 라스돌연변이를 가지고 있으면 저항성을 나타내기 때문에 그 중요성은 한층 증가된 상황이다. 기존에 시도되어 왔던 라스단백질을 타겟으로 하는 항암제 개발은 라스의 활성을 조절하는 것에 초점을 맞추어져 왔으나 돌연변이형 Ras에 활성화를 일으키는 GTP가 pico molar 수준의 높은 친화력 때문에 GTP를 떼어내는 화합물 항암제 개발은 대부분 실패 했고, 최근에 들어서 siRNA와 shRNA 등을 이용한 Ras의 양을 낮추려는 시도가 이루어지고 있으나 물질의 전달 및 특이성 때문에 현재로는 개발이 한계가 있는 상황이며 대부분의 다른 시도들도 실패 한 상황이다. 본 연구진은 10 년간의 연구를 통해서 라스 단백질이 윈트 베타카테닌 신호전달계를 통해서 분해 조절 될 수 있음을 최초로 규명 하였고, 이를 바탕으로 윈트 신호전달계를 저해 하여 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해할 수 있는 저분자 화합물을 발굴하였다. 또한 이 항암제 후보 저분자 화합물이 윈트 신호전달계의 Axin의 N-terminal RGS도메인에 결합하여 GSKbeta 활성화를 통해 Ras를 인산화시켜 분해 하는 메카니즘을 구조 연구를 포함해 자세히 규명하였다. 이를 통해 윈트/베타카테닌과 라스 신호전달계를 동시에 억제할 수 있는 다중표적 혁신항암제 개발의 가능성을 열어주었고 동시에 라스 단백질 분해가 라스를 타겟으로 하는 항암제 개발의 신규전략이 될 수 있음을 입증하여, 라스제어 항암제 개발을 위한 새로운 전략을 제공함.
□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?
본 연구에서 개발한 화합물이 암의 발생과 진행과정을 억제하는 것 이외의 암의 다른 생리학적 성격에는 어떠한 영향을 미치는지를 규명하고 이러한 베타카테닌 및 라스를 동시에 제어하는 화합물이 대장암을 비롯한 다양한 암을 치료할 수 있는 치료제 및 개발 전략으로 널리 활용되길 바란다.
□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?
초기의 이 논문은 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 저해할 수 있는 저분자화합물을 발굴하고 이것의 항앙효과를 대장암 세포와 동물모델에서 확인한 내용으로 구성되었다. 하지만 혁신신약(1st in class) 개발이라는 성격상 논문의 심사과정은 순탄치 않았으며 거듭되는 논문게재의 어려움 때문에 타겟 규명과 기전을 확실하게 하기 위한 수많은 추가적인 연구를 수행해야 하였으며, 이 과정 속에 합성 및 구조를 특이적으로 연구하는 공동연구자들의 도움을 통해서 초기 논문을 작성한지 5년의 시간을 거처 완성도 있는 논문으로 게재 될 수 있었다.
용 어 설 명
1. Nature Chemical biology
네이쳐 퍼블리싱 그룹 (Nature Publishing Group)에서 발행하는 화학생물학 분야의 권위있는 국제학술지
2. 베타카테닌(β-catenin)
윈트 신호전달계의 중요한 구성 단백질로 윈트 신호전달계의 활성화나 돌연변이에 의해 그 양이 많아지고 핵으로 이동하여 세포성장 등을 조절하여 암의 유발에 중요한 역할을 함.
3. 라스 (Ras)
라스는 세포성장을 포함한 다양한 생리/병리현상을 조절하는 단백질로서 모든 암에서 30% 이상의 돌연변이가 발견되는 대표적인 발암유전자이다.
K, H, N-Ras 동형타입이 있으며 돌연변이가 생기면 하위 신호전달계를 활성화하여 세포가 무분별하게 증식하면서 암의 생성 및 진행을 유도하는 것으로 알려져 있다.
4. 윈트/베타카테닌 신호전달계 (Wnt/β-catenin signaling)
세포내에서 다양한 생리 혹은 병리현상을 조절하는 중요한 신호전달계의 하나로 암, 골다공증, 비만, 상처 치유, 모발 형성 등과의 연관성에 대한 연구결과가 최근 발표 되면서 다양한 치료제 개발을 위한 타겟으로 주목받는 신호전달계이다.
5. 액신 (Axin)
β-catenin를 분해하는 데 중요한 단백질들이 결합하는 스캐폴더 단백질로서, 베타카테닌 파괴 콤플렉스를 형성하여 신호전달체계를 음성적으로 조절하는데 중요한 역할을 하는 단백질이다.
6. APC (Adenomatos Polyposis Coli)
윈트 신호전달계의 저해인자로 암발생 초기단계에 관여하여 암 발생을 억제한다
대장암 환자에서 90%의 높은 비율로 돌연변이가 발견되는데 이 같은 변이로 윈트 신호전달계가 비정상적으로 활성화되어 암 발생에 영향을 미치게 된다.
그 림 설 명
그림 1. 베타카테닌과 라스 단백질을 동시에 분해하는 저분자 화합물 KY1220 발굴 및 성격규명.
(a) 야생형 또는 돌연변이 KRAS를 가진 가족샘종폴립증(FAP) 환자의 대장조직에서 면역조직염색법을 수행하여 베타카테닌과 라스 단백질이 종양조직에서 증가되어 있음을 확인함. (b) KY1220 화합물의 구조. (c,d) HEK293 세포에 L-CM 또는 Wnt3a-CM과 함께 KY1220을 처리하고(b) 또는 더하여 MG132(c) 를 함께 처리하여 베타카테닌과 라스가 프로테아좀 분해과정에 의해 감소함을 확인함. (e) HEK293 세포에 Flag-Ub를 과발현 시키고 KY1220을 프로테오좀 저해제인 ALLN과 처리하여 베타카테닌과 라스가 유비퀴틴-의존적 단백질 분해가 일어남을 확인함. (f) D-WT, D-MT 세포에 KY1220을 24시간 동안 처리하여 웨스턴불롯팅을 수행하여 베타카테닌, 라스, K-Ras 감소를 확인하고 각각 밴드의 밝기는 정량대조군인 β-actin과 KY1220가 처리되지 않은 대조군에 대비하여 표준화하여 표시함. (g) SW480 세포에 KY1220을 다양한 시간동안 처리하여 베타카테닌과 라스 및 그 하위조절물질들이 감소함을 확인함. (h) HCT15, SW480, D-WT, D-MT 세포에 25 µM의 KY1220을 처리하여 세포성장이 저해됨을 확인함.
그림 2. KY1220보다 효능이 향상된 KYA1797K 확보.
(a) KY1220보다 활성이 증가된 3가지 유도체의 구조를 나타냄. 빨간원은 윈트/베타카테닌 신호전달계의 활성화를 볼 수 있는 TOPflash 리포터 활성저해에 필수적인 NO2기를 나타냄. (b) KYA1797K의 구조와 함께 빨간원과 파란원은 각각 NO2기와 potassium (K) salt를 나타냄 (위쪽). HEK293 TOPflash 리포터 세포에 KY1220과 KYA1797K를 다양한 농도를 처리하여 리포터 어세이를 수행함 (아래쪽). (c) SW480 세포에 KY1220과 KYA1797K를 표시된 농도로 처리하여 KYA1797K가 더 효율적으로 베타카테닌과 라스 및 그 하위조절물질들을 감소시킴을 확인함. (d) SW480 세포에 KY1220과 KYA1797K를 표시된 농도로 처리하여 콜로니 형성이 KYA1797K에 의해 보다 효과적으로 저해됨을 확인하고 그 수치를 그래프로 표시함.
그림 3. KYA1797K의 타겟 단백질 규명.
(a) HEK293 세포에 ALLN과 KYA1797K를 처리하여 면역침전법을 수행하여 KYA1797K에 의해 베타카테닌과 액신, GSK3β, β-TrCP와의 결합과 β-TrCP와 활성화된 GSK3β에 의해 인산화된 베타카테닌과의 결합을 증가시킴을 확인함. (b) HEK293 세포 용균액을 바이오틴이 붙은 유도체 (LJE-H-225, 활성 유도체; LJE-H-274, 비활성 유도체)와 반응을 하여 LJE-H-225에 액신, 베타카테닌, GSK3β가 결합하고 N-Cadherin, Raf 단백질을 결합하지 못함을 확인함. (c) 재조합 axin 단백질을 LJE-H-225과 반응하여 직접 결합함을 확인하고 KYA1797K를 처리하여 그 결합이 경쟁적으로 제거됨을 확인하여 특이적인 반응임을 확인함. (d) Axin의 3가지 조각의 단백질을 정제하여 LJE-H-225와 반응하여 RGS 도메인이 포함된 axin74-220 조각이 결합함을 확인함. (e) 형광결합어세이를 통해 axin74-220과 KYA1797K가 결합함을 확인함. (f) 야생형과 RGS 도메인이 삭제된 axin 돌연변이를 발현하고 KYA1797K를 처리하여 axin 돌연변이가 발현되면 KYA1797K에 의한 베타카테닌 라스 분해정도가 약해짐을 확인함.
그림 4. KYA1797K와 axin-RGS 도메인의 결합과 GSK3β활성화를 통한 베타카테닌과 라스 단백질 분해 기전 규명.
(a) axin-RGS 도메인이 포함된 74-220 부위와 KYA1797K의 NMR을 이용한 단백질 구조 분석 결과 KYA1797K과 axin74-220가 결합함을 확인함. (b) KYA1797K과 axin74-220결합을 스틱 모델링을 통해 표현함. (c) NMR의 분자도킹모델을 리본 다이어그램으로 표현. (d) KYA1797K과 axin74-220결합을 구조 기반의 파마코포어 특징을 표현함. (e,f) HEK293 세포에 야생형 및 각각의 돌연변이 axin을 발현함. (e) KYA1797K를 처리하여 베타카테닌과 라스 단백질 분해에 미치는 영향을 확인하여 I99, L115, K147 3가지 아미노산의 중요성을 확인함. (f) KYA1797K와 ALLN을 처리하여 면역침강법을 수행하여 axin의 K147A 부위가 KYA1797K 효과에 중요한 아미노산임을 확인함. (g) GSK3β가 삭제된 마우스 배아 섬유아세포에서 KYA1797K에 의한 베타카테닌과 라스 단백질 분해가 일어나지 않음을 확인함. (h) GSK3β에 의해 인산화되는 T144/148부위가 변이된 K-Ras는 KYA1797K에 의해 분해되지 않음을 확인함.
그림 5. 베타카테닌과 라스 단백질 분해를 통한 KYA1797K의 세포성장 저해 효과.
(a,b) SW480, LoVo, DLD1, HCT15 대장암 세포주에서 KYA1797K 농도 의존적으로 베타카테닌과 라스 단백질을 감소시키고(a) 세포성장을 저해하는 것을(b) 확인함. (c-f) 야생형 베타카테닌, 돌연변이 S33Y 베타카테닌, 야생형 K-Ras, 돌연변이 T144/148A K-Ras를 각각 발현 하는 세포를 제작하고 KYA1797K를 처리한 결과, 야생형 베타카테닌과 K-Ras 또한 이 단백질들을 발현하는 세포의 성장은 효과적으로 감소함. 돌연변이 베타카테닌과 K-Ras는 KYA1797K에 의해 분해되지 못하였고 KYA1797K에 의한 이들을 발현하는 세포의 성장저해 효과도 감소함을 확인하였음.
그림 6. KYA1797K의 APC와 K-Ras 돌연변이를 가진 장 관련 암에 미치는 영향 규명.
(a-d) Apc와 Kras돌연변이를 가진 대장암 세포인 D-MT를 누드마우스에 이종이식하고 KYA1797K를 복강투여함. (a,b) KYA1797K를 복강 투여한 마우스에서 종양의 부피(a)와 무게(b)가 크게 감소한 것을 확인함. (c,d) KYA1797K를 투여한 쥐의 종양에서 베타카테닌, 라스 단백질, 그 하위조절 단백질 및 세포성장 마커들의 발현이 감소하는 것을 웨스턴블롯팅(c)과 면역조직염색법(d)을 이용하여 확인함. (e-g) Apcmin/+/KrasG12DLA2 마우스에 KYA1797K를 복강투여함. (e,f) 소장에 발생한 암의 개수가 KYA1797K 처리에 효과적으로 감소함을 확인함. (g) KYA1797K를 투여한 쥐의 종양에서 베타카테닌, 라스 단백질, 그 하위조절 단백질 및 세포성장 마커들의 발현이 감소하는 것을 확인하였음.
