독일 과학자들이 테트라펩타이드(tetrapeptide)를 이용해 세포투과성 펩타이드(CPP)를 만들 수 있다고 보고했다. 이번 연구로 제작된 CPP는 기존에 알려진 것 중에서 가장 작고, 세포 독성도 매우 낮다. 따라서 향후 유전자 전달 물질로 개발될 수 있다고 연구팀은 제안했다. 이번 연구 결과는 독일응용화학지(Angew. Chem.), 2015년 3월 2일자에 보고되었다.
세포를 투과할 수 있는 펩타이드(CPP)들이 최근에 많이 만들어졌다. 다양한 아미노산 조성을 가진 수 백 개의 펩타이드들이 세포막을 통과해 이동할 수 있다고 보고되었다. 이 중에서, 아지닌(Arg)이 풍성한 세포 투과성 펩타이드(CPP)가 세포 흡착이라는 관점에서 가장 높은 효율을 가지고 있으며, 유전자 전달 벡터로 널리 테스트되었다. 하지만, 세포 흡착을 위해서는 적어도 6개의 양전하를 가지고 있어야 하며, 효율적인 유전자 전달을 위해서는 그 이상의 양전하가 필요하다고 알려져 있다. 따라서 여러 연구들이 아지닌이 풍성한 CPP의 능력을 향상시키려고 노력했으며, 지금까지의 전략은 펩타이드 시퀀스 위에 소수성 작용기를 부분적으로 첨가하는 것이었다. 하지만, 여전히 유전자 전달을 위해서는 8~9개의 아지닌 잔기가 필요하며, 향후 여러 가지 응용을 위해서는 이들 펩타이드의 형질 효능(transfection efficacy)과 세포 독성이 더욱 향상될 필요가 있었다. 유전자 전달을 위해서 라이신(Lys) 올리고머가 사용되기도 했지만, 아지닌 CPP보다는 효율적인 면에서 뒤떨어졌다.독일 과학자들은 아지닌의 구아니디움 작용기를 음이온 결합 자리를 모방하는GCP(guanidinocarbonylpyrrole)로 바꾸면, 테트라펩타이드로 만으로도 효율이 매우 좋은 유전자 전달 벡터가 될 수 있음을 발견했다고 보고했다. 일반적으로 아지닌은 라이신보다 DNA응축과 세포막 이동면에서 보다 더 효율적이다. 왜냐하면 아지닌의 구아니디늄은 DNA 안에 있는 음이온 작용기와 두 개의 수소 결합을 할 수 있지만, 라이신의 암모늄 작용기는 비특정적인 정전기 상호작용을 형성하기 때문이다. 연구팀은 GCP가 수용액에서의 구아니딘과 음이온 결합 효율을 크게 향상시킬 수 있다는 점을 이용해, 아지닌이 풍성한 CPPs 내에 GCP가 도입된 펩타이드를 합성했고, 이를 통해 CPP의 DNA 결합과 세포막에 대한 결합이 향상되며, 향후 보다 성능이 좋은 벡터가 될 것이라고 연구팀은 가정했다.
그림 1형질 효능(transfection efficacy) 연구에 사용된 올리고펩타이드 1–3. 양이온 작용기와 카르복시기 또는 인산화기 같은 옥소 음이온과의 상호작용의 특이성은1≫2>3 순서로 줄어든다
연구팀은 합성한 펩타이드 1 유사체는 저분자와 펩타이드의 전하의 숫자에 비해서 매우 좋은 형질 능력을 보여주었다고 말했다. 또한 네 개의 아미노산을 가진 작은 펩타이드로 세포 안으로 이동할 수 있게 한 것은 이번 연구가 처음이라고 강조했다. 연구팀은 HEK-293와 NIH/3T3 세포주를 이용해 펩타이드 1유사체의 인공 형질 벡터를 시험했다.
더욱 중요한 것은 GCP를 이용한 벡터의 잠재적인 응용 가능성을 보여준 것은, 세포 독성이 매우 낮다는 데 있다. 연구팀은 HeLa 세포 주에서 측정된 대사성 활동이 0.15mM으로 독성이 무시할 만했다는 점이다. PEI의 경우에는 이 농도에서 거의 70%의 세포 생존 능력이 줄어들었다.
테트라펩타이드 1유사체의 효율이 획기적으로 향상된 이유를 밝히기 위해선, 변형되지 않은 테트라펩타이드를 사용했다. 이를 통해 연구팀은 펩타이드를 이용할 경우 6개 이상의 전하가 있어야 세포막으로 이동할 수 있음을 재차 확인했다. 연구팀은 펩타이드1 유사체의 GCP 작용기가 세포막의 음전하 작용기와의 특정 결합 상호작용이 일어나기 때문으로 설명했다. 이 설명과 일치하는 실험으로, 연구팀은 아지닌 옥타머의 수소 결합 능력이 줄어들면 세포 흡착도 줄어든다는 것과 같다. 따라서 세포막과 함께 일어나는 특정한 결합은 CPP의 세포 흡착 메커니즘에서 매우 중요한 역할을 한다.
연구팀은 또한 1번 물질이 보다 좋은 세포 흡착이 일어나는 이유로, GCP 작용기의 pKa 값이 낮아서 결과적으로 엔도좀(endosomes) 내의 완충 능력이 늘어나기 때문이라고 설명했다.
연구팀은 GCP 작용기를 이용함으로써 CPP-매개 유전자 전달을 향상시킬 수 있다고 보고하면서, 이번에 개발된 펩타이드는 상업용 시약인 PEI보다 더 효율이 좋고, 특히 낮은 세포 독성을 보인다는 점을 강조했다. 세포-투과성 펩타이드에 의한 유전자 전달에서 특정 결합 상호작용의 역할을 규명하기 위한 연구를 수행 중이라고 밝혔다.
