한국연구재단은 (조선대 의과대학) 연구팀이 암세포에서 형성되는 스트레스과립^*이 세포 내 네딜화^**(NEDDylation)를 유도하는 신호전달체계에 의해 형성된다는 사실을 밝혀냈다.

    

스트레스과립은 단백질 복합체로서 암세포가 저산소 상태, 영양분 부족 등과 같은 환경의 스트레스 조건에 처했을 때 형성된다. 암세포 내에 형성된 스트레스과립은 약물이나 방사선 치료에서 내성^*을 나타내어 치료의 효율을 저하시킨다. 그러나 어떠한 기전으로 스트레스과립이 형성되는지는 아직 밝혀지지 않았다.

   

이에 연구진은 스트레스과립이 네딜화를 통해 형성된다는 사실을 밝혀냈다. 네딜화는 암세포가 스트레스를 받을 시 스트레스반응의 일환으로 작동한다. 이로 인해 네딜화의 주요 구성 단백질인 NEDD8^*은 다른 단백질과 결합하여 그 단백질의 기능을 변화시킨다. 특히 네딜화 작용 중 단백질 UBE2M과 SRSF3은 스트레스과립에 중요한 영향을 끼친다.

UBE2M은 네딜화 신호전달체계에 필수적 역할을 하는 효소로서 스트레스과립 형성에 필수적인 유전자 100여개 중 하나이다. 연구진은 UBE2M 발현을 억제했을 때, 스트레스과립의 형성이 강력하게 저해된다는 것을 확인하였다. 네딜화 신호전달체계에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 저해했을 경우에도, 동일한 결과가 나타나는 것을 확인하였다. 

특히 연구진은 네딜화를 통한 스트레스과립의 형성 메커니즘을 구체적으로 규명하고자 하였다. 

연구진은 프로테오믹스 분석법^*을 활용하여 네딜화를 통해 변형되는 단백질들을 규명하였다. 그 결과 스트레스과립의 구성요소이며 발암단백질로 알려진 SRSF3^**을 발견하였다.

    

 

또한 돌연변이법^*을 활용하여 SRSF3의 리신85번^**에 NEDD8이 부착(네딜화)되는 것을 확인하였다. 연구진은 SRSF3 아미노산인 리신 85번을 성질이 다른 아미노산인 아르기닌^***으로 대체한 돌연변이체를 제작하여 암세포에 도입했을 때 스트레스과립 형성이 차단됨을 확인하였다.

    

결론적으로, 암세포에 스트레스가 가해졌을 때 1) 세포 내 네딜화 신호전달체계가 작동하게 되고 2) 스트레스과립의 구성단백질인 SRSF3의 네딜화가 유도되어 3) 스트레스과립 구성요소들을 응집시키는 결과가 나타나는 것이다. 

온탁범 교수는“이번 연구에서 항암 치료 시, 약물 내성의 원인으로 알려진 스트레스과립 형성 과정을 분자적 수준에서 밝혔다. 이는 내성발생 기전을 조절하여 스트레스과립의 형성을 제어할 수 있는 효과적 항암 치료기술의 개발에 크게 기여할 것으로 기대된다.”라며 연구의 의의를 설명했다. 

미래창조과학부 기초연구사업인 선도연구센터(MRC)의 지원을 받은 이번 연구성과는 세계적으로 저명한 국제학술지인 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications) 7월 6일자에 게재되었다.

- 논문명 : NEDDylation promotes stress granule assembly

 

- 저자 정보 : 온탁범 (교신저자, 조선대), 아라빈스 쿠마르 자야바란 (제1저자, 조선대 박사), 박라영 (공동저자, 조선대 박사), 앤서니 산체즈 (공동저자, 사우스플로리다 대학 석사), 윤상필 (공동저자, 제주대), 강금용 (공동저자, 다이아텍), 백제현 (공동저자, 다이아텍), 폴 앤더슨 (공동저자, 하버드의대), 기영훈 (공동저자, 사우스플로리다 대학) 

진행성 암환자의 치료에 있어 효과적인 방사선 및 항암제를 이용한 치료는 암환자의 생존률과 밀접한 연관성을 가지고 있다. 

암세포의 방사선 및 항암치료에 내성을 부여하는 원인을 밝힘으로써 효과적인 항암치료법 개발이 필요하다.

스트레스과립^*을 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있는 모델 세포주를 제작하여 RNAi 스크린^*을 통해 스트레스과립 형성에 필수적인 역할을 하는 유전자들을 찾아냈다.  네딜화(NEDDylation) 신호전달체계의 주요 구성인자인 UBE2M이 스크린에서 확인되었다. 또한 네딜화 신호전달체계의 다른 구성요소들의 기능을 차단하여 스트레스과립 형성의 중요성을 확인하였다. 

       

스트레스과립을 구성하는 단백질들 중 네딜화의 타깃이 되는 단백질을 흡착정제법과 질량분석법을 수행하여 동정하였다. 스트레스과립의 필수 구성요소인 SRSF3 단백질^*이 확인되었고, 스트레스에 반응하여 네딜화의 타깃이 된다는 사실을 확인하였다. SRSF3 리신을 아르기닌^*으로 치환한 돌연변이체들을 제작하여 네딜화가 일어나는 리신85번^*을 동정하였고, 아르기닌으로 치환된 돌연변이체를 세포 내로 도입하였을 때 스트레스과립 형성이 차단되는 현상을 관찰하였다. 

       

스트레스과립이 암세포의 방사선 또는 항암치료에 내성을 부여하고, 생존률을 높이는 결과들은 이전에 관찰이 된 바 있으나, 스트레스과립이 어떤 분자적 메커니즘을 통해 응집되는지는 밝혀진 바가 거의 없다. 이 연구에서는 암세포에 스트레스가 가해졌을 때 세포 내 네딜화 신호전달체계가 활성화되고, 스트레스과립의 주요 구성 단백질인 SRSF3의 리신85번에 네딜레이션을 유도함으로써 스트레스과립의 응집이 일어난다는 구체적인 분자적 메커니즘을 밝혔다. 

향후 스트레스과립 형성을 차단하는 기술을 개발하여 효과적인 항암치료에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 

암세포는 비정상적인 활발한 증식력으로 인해 저산소증, 영양분 부족과 같은 다양한 종류의 스트레스에 노출되어 있다. 이와 같은 스트레스반응의 일환으로 암세포는 스트레스과립 (Stress granule)이라는 세포 내 응집체를 형성하게 되고, 이를 통해 암세포의 스트레스 극복 및 생존력을 극대화하는 것으로 알려져 있다. 최근에 이러한 스트레스과립에 의해 암세포의 방사선 및 항암제 내성이 유도되어 치료에 어려움이 있는 것으로 보고가 되었다.  

스트레스 과립의 형성을 효과적으로 차단할 수 있다면 효과적인 항암치료의 전기를 마련할 수 있을 것이다. 이를 위해 스트레스과립이 세포내 어떤 분자적인 기전에 의해 응집되는지를 밝혀내는 연구가 필요하다. 

스트레스과립의 형성이 세포 내 어떠한 신호전달체계와 그 하류의 효과자(effector)들에 의해 이루어지는지 알려진 바가 거의 없다. 스트레스과립의 형성의 분자적 메커니즘을 규명하기 위해 스트레스과립의 형성에 필수적인 유전자들을 대규모 RNA 간섭기술^*을 통해 탐색한 결과, 기존에 암세포 증식 및 생존에 관련된 분자적 타깃들의 기능을 조절하는 NEDD8 단백질 변형(NEDDylation) 신호전달체계가 스트레스과립의 형성에 필수적인 역할을 한다는 새로운 사실을 밝혀내었다. 

       

네딜화(NEDDylation) 신호전달체계를 구성하는 주요한 효소들의 발현을 억제하였을 때, 스트레스과립의 응집이 현저히 감소하는 양상을 관찰하였다. 또한 약물을 이용하여 네딜화(NEDDylation)를 억제하였을 때에도 유사한 결과를 관찰하였다. 

네딜화를 통해 변형이 되는 하위 효과자(단백질)를 규명하기 위해 통합단백질탐색(프로테오믹스) 접근법을 활용하였고, 네딜화 신호전달체계의 타깃으로 기존에 발암단백질로 알려진 SRSF3가 있음을 밝혀 내었다. SRSF3단백질의 아미노산중 네딜화가 유도되는 리신잔기를 규명하기 위해, 리신잔기가 아르기닌으로 치환된 다양한 돌연변이체를 제작하였으며, 그 결과 85번째 리신에 네딜화가 유도되는 것으로 확인되었다. 리신85번이 아르기닌으로 치환된 돌연변이 유전자를 세포내로 도입하여 발현을 유도했을 때, 스트레스과립의 형성이 효과적으로 차단됨을 관찰하였다. 결론적으로 암세포가 방사선치료, 항암제를 비롯한 다양한 스트레스에 직면했을 때, 네딜레이션 신호전달체계가 작동이 되고, 그 하류의 SRSF3가 네딜화됨으로써 스트레스과립이 형성되는 것이다.

암세포의 항암치료내성 및 생존력에 관한 연구들이 오래 전부터 지속되어져 왔으나, 스트레스과립과의 연관성은 최근에 와서야 주목을 받기 시작하였다. 암세포의 스트레스과립의 구체적인 역할 및 형성의 분자적 메커니즘을 자세히 밝혀냄으로써 암세포의 치료내성을 더욱 효과적으로 제어할 수 있는 길이 열릴 수 있을 것이라 기대된다.

연구팀의 주요 연구주제는 세포의 스트레스 반응이며, 그 반응의 주요 산물인 스트레스 과립 (stress granule)이다. 최근 연구들에 의하면, 스트레스과립이 암세포의 생존력을 증가시키고, 스트레스과립의 조절에 이상이 생겼을 때 다양한 퇴행성신경질환들의 원인이 될 수 있다는 연관성이 보고되기 시작하였다. 하지만 스트레스과립이 어떠한 분자적 메커니즘에 의해서 형성이 되는지에 대한 연구가 되어 있지 않아 이에 관심을 가지고 수년 간 연구를 진행해 왔다. 

본 연구책임자는 수년전 스트레스과립의 형성에 중요한 역할을 하는 유전자들을 규명하는 일을 했으며, 그 결과로 네딜레이션(NEDDylation) 신호전달체계에 중요한 유전자인 UBE2M을 찾아내었으며, 이를 토대로 네딜레이션 신호전달체계와 스트레스과립 형성과의 연관성을 규명하는 연구를 진행해 왔다. 추가적으로 네딜레이션 신호전달체계에 의해 하류에 위치하는 발암단백질인 SRSF3가 변형이 되고, 이로 인해 스트레스과립이 형성될 수 있다는 새로운 사실을 규명해 내었다. 

네딜레이션 신호전달체계를 연구하는 시스템이 연구실에 갖춰지지 않아, 어려움이 있었고, 또한 네딜레이션에 의해 변형이 되는 단백질들을 규명하는데 적절한 시스템을 구축하는 과정이 매우 어려웠다. 다행히 세포내바이오틴화(in vivo biotinylation) 시스템을 우연히 알게 되어, 효과적으로 네딜레이션 타깃이 되는 단백질들을 동정하는 방법을 자체 개발하여 성공적으로 적용할 수 있었다.

위에 언급한대로 스트레스과립에 연관성이 있는 유전자들은 이미 동정이 되어 있는 상태이나, 이러한 유전자들에 암호화된 단백질들이 어떠한 분자적 메커니즘에 의해 스트레스과립의 형성에 기여를 하는지는 알려진 바가 거의 없다. 이 연구에서는 스트레스과립의 형성과 NEDDylation 신호전달체계와의 연관성을 최초로 규명하였고, 더 나아가 하류단백질인 SRSF3에 NEDDylation이 됨으로써 스트레스과립의 응집이 유도된다는 구체적인 분자적 메커니즘도 밝혀냈다. 

스트레스과립이 암세포의 방사선 및 항암제에 대한 내성에 연관성이 있다는 보고들이 최근 들어 발표되기 시작하였다. 또한 추가적으로 비정상적인 스트레스과립이 퇴행성 뇌질환과 연관되어 있다는 보고도 발표되기 시작하였다. 향후 스트레스과립의 방사선 및 항암제 치료내성과의 연관성에 대한 구체적인 분자적 메커니즘을 연구하여 더욱 효과적인 치료제 발굴에 적용하는 것이 목표이다. 또한 기회가 된다면 퇴행성 뇌질환에서의 스트레스과립의 병원성을 구체적으로 연구하는 것도 또 하나의 큰 목표이다. 

한국에 들어와 실험실을 만들어 나가면서 처음으로 시작한 큰 연구프로젝트였지만 이 연구가 과연 실현이 될지 항상 의구심을 가지고 있었다. 하지만 꼭 밝혀내고 싶었던 연구였고, 또한 열심히 공부하고 연구하는 대학원생을 보며, 어려움에 부딪혀도 꿋꿋이 정진해 나가자는 마음 가짐으로 임했다. 뜻이 있는 곳에 길이 있다고 어려움이 닥칠 때마다 항상 길은 보였고, 결과적으로 이런 좋은 결과가 나온 듯하다. 내가 이 프로젝트를 진행하며 겪었던 모든 어려움에 감사한다. 

. Nature Publishing Group에서 발간하는 네이처 자매지

. 스트레스에 의해 세포질내에 응집되는 RNA와 다양한 종류의 단백질 (Protein) 복합체 (Complex)

. 단백질 변형체계로서 NEDD8이라는 11 kDa의 작은 단백질이 다른 종류의 단백질의 리신(lysine) 잔기에 공유결합하는 과정으로, NEDD8이 결합된 단백질은 그 기능이 변하게 된다.

. 분자 간의 특이적 친화성을 이용해 이질적인 복합체에서 원하는 물질만 분리⦁정제해 내는 과정을 일컫는다.

. 질량분석을 통한 액체 크로마토그래피법

. RNA 간섭기술로서, 특정 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 이루는 siRNA (small interfering RNA)를 세포내로 도입하게 되면 그 mRNA가 분해되어 없어져 궁극적으로 단백질로의 발현이 차단된다. 

. 발암단백질의 일종으로, 암세포에서 발현이 증가된 것으로 보고됨. 

. 아미노산의 일종

. SRSF3 단백질을 구성하는 아미노산 서열중 85번째 해당되는 아미노산

. 네딜레이션 체계를 구성하는 효소로서 NEDD8 단백질을 타깃 단백질에 전달하는 역할을 한다.

                 

     

스트레스에 의해 세포 내 스트레스를 인지하는 스트레스 키나아제 (Stress kinase)와 NEDDylation 신호전달체계가 활성화되어 세포 내 단백질 번역과정들이 중단된다. 번역이 중단된 mRNA들과 다양한 종류의 단백질들, NEDDylation 신호전달체계에 의해 변형이 된 SRSF3가 다른 단백질들과의 응집을 유도하여 스트레스과립이 형성된다.