재조합의약품 시험정보집 4

질량분석기를 이용한 유전자재조합의약품의 단백질 특성분석 시험법

[소마트로핀의 LC-MS 및 MALDI-TOF 분석법]

Analytical Methods for Characterization of

Biotherapeutic Proteins by Mass Spectrometry

2014. 6.

식품의약품안전평가원

서  문

세계 의약품 시장은 합성화학의약품이 신약 개발의 한계에 부딪히고 거대 제약회사들이 바이오의약품 개발에서 활로를 모색하면서 점차 바이오의약품 비중이 증가하고 있는 추세이다. 구체적으로 2008년에는 전체 의약품시장 6,430억 달러 중 바이오의약품은 약 17%인 1,080억 달러 규모를 차지하였으나 2014년에는 1,690억달러 규모로 성장하여 전체 의약품시장의 23%를 차지하게 될 것으로 예상되고 있다. 바이오의약품에는 유전자재조합의약품, 유전자치료제, 세포치료제 등이 있으나 유전자치료제와 세포치료제는 아직 제품화 초기 단계이고 실질적으로 바이오의약품 시장을 주도하고 있는 것은 유전자재조합의약품이다. 다른 한편 블록버스터급 유전자재조합의약품들이 2020년전까지 특허가 만료됨에 따라 비교적 단기간에 글로벌 산업화가 용이한 바이오시밀러 개발은 국내 제약사들에게 글로벌 신약개발 및 세계시장 진출을 위한 절호의 기회로 부각되고 있다.

유전자재조합의약품은 의약적으로 유용한 인간 유전자 산물을 동물세포나 미생물을 활용하여 생산한 것으로 단백질을 주성분으로 하고 있다. 그런데 단백질은 일반 합성화학의약품에 비해 크기가 매우 크고 구조가 복잡하기 때문에 제품 개발 과정에서 특성분석은 고도의 분석기술과 전문지식을 필요로 하는 분야이다. 또한 유전자재조합의약품의 특성분석법은 제품의 품질 평가에도 활용되기 때문에 정확하고 효율적인 특성분석법은 제품의 개발 및 품질 관리 모두에서 핵심 요소이다.

이와 관련하여 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원에서는 지속적인 연구사업 수행을 통해 최신 분석기술을 반영한 유전자재조합의약품 특성분석법을 개발하고 관련 정보를 체계적으로 정리하여 관련 업체는 물론 허가심사자들에게 제공함으로써 국내 바이오의약품 산업 발전에 기여하고자 노력해왔다. 본 시험정보집도 이와 같은 노력의 일환으로 제작되었으며 최근 단백질 특성분석 분야에서 빠르고 정확한 분석 결과를 제공함으로써 주목받고 있는 질량분석기술을 활용한 단백질의약품의 특성분석법 및 시험법 검증을 주내용으로 담고 있다. 아무쪼록 본 시험정보집이 국내 유전자재조합의약품 개발 촉진과 국민에게 안전한 고품질의 바이오의약품을 공급하기 위한 바이오의약품 허가심사에도 미약하나마 도움이 되길 기대한다.

목 차

I. 단백질의약품의 특성분석 및 질량분석기의 활용 ------------------------	1
II. 질량분석기를 이용한 단백질의약품 특성분석법 -----------------------------	3
1. LC-MS 와 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 단백질 분자량 측정 -------------------------------	3
2. LC-MS 분석을 위한 단백질 분해효소 (Trypsin) 처리 조건 최적화 -----------------------------	4
3. MALDI-TOF MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 분석 --------------------------------------	6
4. LC-MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 및 펩티드 지도 분석 ---------------------------------	6
5. LC-MS/MS를 이용한 아미노산 서열분석 ------------------------------------------------	8
6. LC-MS 와 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 s-s 결합 분석 -----------------------------------	10
III. 재조합의약품 (소마트로핀)의 특성분석 및 검증 시험법 SOPs ------------	16
1. LC-MS 장비를 이용한 단백질 분자량 측정 ----------------------------------------------	16
2. MALDI-TOF MS 장비를 이용한 단백질 분자량 측정 ----------------------------------------	18
3. 단백질 분해효소 처리 조건 최적화 시험법 -----------------------------------------------	20
4. LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석 시험법 -------------------------------------------	22
5. LC-MS를 이용한 펩티드 지도 분석 시험법 ----------------------------------------------	24
6. MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석 시험법 ------------------------------------	26
7. LC-MS/MS를 이용한 아미노산 서열분석 시험법 ------------------------------------------	28
8. LC-MS를 이용한 s-s 결합분석 시험법 -------------------------------------------------	31
9. MALDI-TOF MS를 이용한 s-s 결합분석 시험법 ------------------------------------------	34
IV. 재조합의약품 (소마트로핀)의 특성분석 시험법 검증 결과 ---------------	37
1. LC-MS 장비를 이용한 분자량 측정 시험법 검증 ------------------------------------------	37
2. MALDI-TOF-MS 장비를 이용한 분자량 측정 시험법 검증 -----------------------------------	37
3. LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석시험법 --------------------------------------------	38
V. 참고문헌 ---------------------------------------------------------	39

I. 단백질의약품의 특성분석 및 질량분석기의 활용

유전자재조합 단백질의약품은 유전자재조합 기술을 사용하여 의약적으로 유용한 인간 유전자를 동물세포나 미생물 세포에서 발현시켜 얻어지는 단백질을 주성분으로 하며 대표적인 예로는 인슐린, 성장 호르몬, 인터페론, 항체 등이 있다. 단백질의약품은 크기와 구조면에서 합성화학의약품과 대비된다. 즉 단백질의약품은 크기가 상대적으로 매우 크다. 예를 들어 잘 알려진 합성화학의약품인 아스피린은 분자량이 180 daltons인데 비하여 단백질의약품 중 분자 크기가 작은 편에 속하는 인슐린도 5808 daltons 이나 되며 보통 수만 daltons의 크기이다(예 성장호르몬 약 22,000 daltons, 인터페론 약 19,000 daltons, 항체의약품은 평균 약 25,000 daltons). 크기 뿐 아니라 구조도 합성화학의약품과 비교할 수 없을 만큼 복잡하여 흔히 자건거와 비행기간 차이에 비유되기도 한다(그림 1). 큰 크기와 복잡한 구조 때문에 단백질의약품은 제조 과정도 복잡하고 더구나 생물체를 이용하기 때문에 균질성을 유지하기도 어렵다. 따라서 제조과정 및 제조 후 제품의 특성분석(구조 등 물리화학적 특성, 생물학적 활성 및 순도 등)과 품질평가는 단백질의약품 산업의 핵심요소이다.

a)                     b)                      c)

그림 1) 합성화학의약품(a)와 재조합단백질의약품(b,c)의 구조 비교

a) aspirin b) somatropin c) immunogloblin

단백질의약품의 특성분석 중 특히 구조 등 물리화학적 특성의 확인에서 질량분석기의 활용이 최근 주목받고 있는데 그 이유는 질량분석기의 빠르고 정확한 분석능과 미량을 사용한 분석이 가능하다는 장점 때문이다. 질량분석기는 1912년 Thompson에 의해 처음 만들어진 후 단백질은 물론 각종 천연물 및 합성물질에 대한 분석 기술이 개발되었으며 의약품 개발을 포함한 다양한 분야에 활용되고 있다. 질량분석기를 이용한 단백질 특성분석은 1993년 영국 Imperial Cancer Research Fund의 A. J. Bleasby와 Genentech사가 각각 독립적으로 Peptide mass fingerprinting (PMF) 기술을 개발하면서 본격적으로 기술개발이 이루어졌다. PMF 기술은 미지의 단백질을 단백질 분해효소로 작은 크기의 펩티드로 절단하여 MALDI-TOF-MS 나 ESI-MS와 같은 질량분석기를 이용하여 분석하는 기술로 아미노산 서열에 대한 database를 활용한다. 한편 전형적인 PMF 기술은 단백질의 분리 정제를 필요로 하지만 1999년 캘리포니아 대학의 Alma L. Burlingame 연구팀에서는 개발한 Tandem(MS/MS) 분석법을 통해 2-3가지 이상 혼재되어 있는 소량의 단백질도 구분하여 분석할 수 있게 되었다.

HPLC와 UV 검출기를 이용한 단순한 peptide profile 분석과 달리 LC-MS 등 질량분석기는 아미노산 서열까지 정확하게 분석할 수 있기 때문에 질량분석기를 활용한 구조 분석은 향후 특성분석 분야에서 점점 더 큰 비중을 차지할 것으로 예상된다(그림 2). 현재 Thermo, Waters, AB SCIEX 등 해외 분석기기업체들은 저마다 장점을 지닌 고감도 고효율 질량분석기를 생산 판매하고 있으며 세계의 거대제약회사들은 모두 질량분석기를 단백질의약품의 특성분석에 활용하고 있다. 한편 국내에서도 질량분석기술의 중요성과 활용 필요성이 증가됨에 따라 많은 제약업체들이 질량분석기를 보유하고 있거나 향후 보유 계획을 세우고 있는 상황이다.

그림 2. 질량분석기를 이용한 단백질 특성분석 흐름도

II. 질량분석기를 이용한 단백질의약품 특성분석법

1. LC-MS 와 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 단백질 분자량 측정

전통적으로 단백질의 분자량은 Sodiumdodecylsulfate - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 나 Gel Permeation Chromatography (GPC) 등을 사용해서 측정할 수 있으나 정밀한 분자량을 측정할 수 있는 장비로 최근 질량분석기의 활용이 증대되고 있다. 본 시험법에서는 LC-MS와 MALDI-TOF MS 장비를 이용하여 단백질 분자량 측정법을 확립함으로써 정확한 측정법으로의 분석법 고도화와 분석장비 형태별로 다양화 시키고자 한다.

LC-MS 장비를 이용한 단백질 분자량 측정

본 시험법에서는 소마트로핀의 분자량 측정을 위해서 Thermo사의 LTQ Orbitrap XL모델의 LC-ESI-MS질량분석기를 활용하여 LC결과와 분자량 정보를 동시에 분석할 수 있는 분석법을 제시하였다. ESI-MS 질량분석기에서는 단백질이 이온화되어 다가 (multiple charge) 이온을 형성하게 되고 이러한 질량분석 스펙트럼을 디콘볼루션 (deconvolution) 과정을 거쳐 정확한 분자량 측정이 가능하며, 용매 조건에 따른 피크모양과 질량 분석 스펙트럼의 상태를 종합적으로 고려하여 LC-ESI-MS를 이용한 분자량 측정 방법을 최적화하는 분석조건을 제시하였다 (표 1).

표 1. LC-ESI-MS를 이용한 분자량 측정 장비 및 분석조건

MS Instrument	LTQ OrbitrapXL (Thermo)
LC Instrument	Accela UPLC (Thermo)
Column	BEH300 C4 2.1x100mm,1.7μm (Waters)
Elution condition	Solvent A: DW (0.1% Formic acid) Solvent B: n-Propanol

상기 표 1의 분석조건은 빠른 분석을 수행하기 위한 크로마토그래피로 UPLC를 사용하였으며, 역상 컬럼으로 C4 컬럼을 사용하여 분석법을 구축하였으며, 용출 용매는 0.1 % formic acid와 0.1 % TFA를 비교분석하여, 질량분석 스펙트럼이 우수한 formic acid를 포함하는 용매로 선정하였고, acetonitrile보다 크로마토그램의 모양이 우수한 n-propanol을 이용하여 분석법을 최적화시켰다.

MALDI-TOF 장비를 이용한 단백질 분자량 측정

MALDI-TOF 형태의 질량분석기는 넓은 분자량 범위의 단백질들을 단시간에 측정할 수 있으며, 주로 [M+H]+의 1가 이온의 질량스펙트럼을 생성함으로써 단백질의 분자량을 직관적으로 확인하기에 좀 더 편리한 장비로 널리 활용되고 있다. 본 시험법에서는 단백질분석에서 많이 사용되고 있는 Sinapinic acid를 Matrix로 하여MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 소마트로핀 분자량 측정법을 확립하였다.

2. LC-MS 분석을 위한 단백질분해효소 (Trypsin) 처리조건 최적화

기존의 특성분석에서 펩티드 프로파일 분석은 일반적으로 단백질 분해효소를 처리하여 펩티드를 생성 후 HPLC분석을 수행하게 된다. 질량분석기를 이용한 펩티드 프로파일 분석도 HPLC와 같이 단백질 분해효소를 이용하여 질량분석기로 분석하기 알맞은 크기의 펩티드 조각으로 분해한 다음 각각의 펩티드 조각을 질량분석기로 분석을 수행하여야 한다. 단백질로부터 펩티드를 생성하기위해 사용되는 단백질 분해효소로는 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), Glu-C, Lys-C, Asp-N (그림)등 특정 아미노산을 인식하여 일정한 펩티드를 생성시킬 수 있는 효소를 활용하는데 소마트로핀의 아미노산 서열분석법 구축을 위한 본 시험법에서는 United States pharmacopeia(USP, 미국약전)와 European Pharmacopoeia (EP, 유럽약전)에서 펩티드 프로파일 분석에 사용되는 trypsin 효소를 사용하여 최적화 과정을 수행하였다.

그림 3. 단백질 분해효소의 아미노산 분해 위치

단백질 효소의 가수분해를 반응 시 urea를 사용하여 단백질의 3차 구조를 풀어 trypsin 효소가 좀 더 효율적으로 작용할 수 있도록 단백질의 구조를 변성시켜 반응을 진행하여 urea를 사용하지 않은 전처리 방법과 비교분석을 수행하였으며, 그 결과 urea를 사용했을 경우 좀더 효과적으로 반응함을 확인하고, 효소 반응시 urea를 처리하는 것으로 방법을 최적화 시켰다. 또한 단백질 가수분해 효소와 단백질의 반응 비율 등에 대한 효소처리 반응조건에 따른 질량분석 크로마토그램 최적화를 수행하여, Trypsin 효소와 단백질의 비율이 1:50인 조건으로 분석법을 최적화 하였다. (그림 3)

그림 4. 효소와 단백질의 반응 비율에 따른 질량분석 크로마토그램 비교분석

3. MALDI-TOF MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 분석

최적화된 단백질분해효소 (Trypsin) 처리조건에 따라 효소처리된 펩티드를 MALDI-TOF 장비로 분석이 가능하다. MALDI-TOF MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 분석법은 LC-MS 분석법에 비해 분석시간이 짧아 단시간에 분석이 가능한 장점이 있으나, 분석결과의 재현성이 LC-MS에 비해 낮으며 LC-MS 장비와 달리 펩티드들을 분리하는 장치가 없기 때문에 서열이 다르나 분자량이 같은 펩티드가 동시에 측정되는 단점이 있다.

4. LC-MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 및 펩티드 지도 분석

LC-MS 장비를 이용한 펩티드 프로파일 분석

USP나 EP의 펩티드 프로파일 분석법은 HPLC 분석을 수행하며, LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석은 UV 결과를 측정하는 HPLC 분석법 과는 달리 각각의 펩티드에 대한 질량값 정보를 측정하게 된다. HPLC를 이용한 펩티드 프로파일 분석은 패턴비교는 가능하나 각각의 피크에 대한 동정이 불가능하며, 바이오시밀러 개발시 오리지널 의약품과 패턴의 비교 분석 시 상이한 결과를 얻었을 경우 원인 분석 등을 위해서는 질량분석 결과가 필수적으로 필요로 한다.

본 시험법에서는 절단된 펩티드의 분석을 위해서 BEH 130 C18 (2.0 x 100mm, 1.7um, waters) 컬럼을 이용하여 분석법을 구축하였고, 용출조건을 최적화 하여 각각의 펩티드를 분리시켜 질량분석 크로마토그램을 측정하였다. LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석법은 HPLC 분석결과와 유사하게 크로마토그램 결과를 비교분석 할 수 있으며(그림 5), 각각의 피크에 대한 질량값 정보를 동시에 포함하고 있기 때문에 이후 피크 동정과 펩티드맵 작성에 중요한 정보를 제공할 수 있다.

그림 5. LC-MS를 이용한 소마트로핀 표준품의 펩티드 프로파일 분석

LC-MS 장비를 이용한 펩티드 지도 분석

펩티드 프로파일 분석결과 최종적으로 프로파일 결과에 대한 피크동정과 펩티드 맵을 작성해야 한다. 팹티드맵 작성은 각각의 펩티드피크에 대한 정보를 측정해야 함으로 질량분석기의 활용이 필수적이라 할 수 있다.

본 시험법에서는 고분해능 질량분석기를 이용하여 펩티드의 분자량을 측정하고 trypsin 효소에 의해 생성될 수 있는 소마트로핀의 펩티드 목록과 비교분석을 수행하여 펩티드맵을 작성하였다(그림 6).

그림 6. 펩티드 지도 분석을 통한 단백질 특성분석

(A) 질량분석기를 사용하여 단백질 분해효소 처리를 통하여 얻어진 펩티드의 질량 값(m/z)을 측정,(B)Data base에서 특이적인 단백질 분해효소 처리의 의해 얻어지는 이론적인 펩티드 질량 값(m/z)  계산, 측정된 펩티드 질량값과 계산된 이론값을 비교 분석하여 폡티드 지도 완성 (출처: Curr Opin Biotechnol. 2000, 11: 391-395 )

5. LC-MS/MS를 이용한 아미노산 서열분석

소마트로핀 단백질에 trypsin 분해효소를 처리 후 LC-MS분석을 통하여 이론적으로 생성될 수 있는 펩티드의 분자량과 실제 측정된 질량분석 스펙트럼의 분자량을 비교분석하여 단백질의 아미노산 서열분석 수행하여야 한다. 소마트로핀 단백질은 trypsin 효소에 의해 완전히 분해되었을 경우 이론적으로 21개의 펩티드 조각이 생성될 수 있으며, 질량분석기를 이용한 펩티드 조각 각각의 스펙트럼에 대한 분자량 및 이온화 차수 분석을 수행하였다.

질량분석 스펙트럼을 이용한 펩티드 서열분석결과, 분자량이 작은 T17, T18 펩티드 조각을 제외한 모든 펩티드 조각의 아미노산 서열을 확인하였다.

Trypsin 분해효소에 의해 완전히 분해되지 못하고 부분적으로 분해되지 않은 펩티드 조각이 생성될 수 있으며, 이들 조각에 대한 스펙트럼 분석을 수행하여 길이가 짧아서 동정되지 않았던 T17, T18 펩티드 조각의 아미노산 서열이 분석 가능하였고, 최종적으로 소마트로핀 단백질의 100 % 아미노산 서열을 확인하였다.

질량분석기를 이용한 아미노산의 서열분석은 펩티드를 질량분석기내에서 조각화 시키고 각 조각의 질량분석 스펙트럼간의 분자량 차이를 계산하여 아미노산의 서열을 분석하게 된다. 이러한 분석법을 MS/MS 또는 tandem MS라고 하며, MS/MS 방식으로는 CID, HCD, PQD, ETD, ECD방식 등이 사용되고 있으며, CID 방식을 가장 일반적으로 많이 사용되고 있다.

본 시험법에서도 Thermo사의 LTQ장비를 이용하여 CID fragmentation을 수행하였고, data dependent 기능을 사용하여 intensity가 높은 펩티드의 피크를 자동적으로 선택하여 MS/MS가 진행되도록 하였다. 결과분석은 Thermo사의 Proteome Discoverer 프로그램을 사용하여 분석을 수행하였으며,  각각의 펩티드에 대한 분석결과를 제시하였다(그림 7).

그림 7.  LC-MS/MS를 이용한 FPTIPLSR 펩티드 서열분석

6. LC-MS 와 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 s-s 결합 분석

LC-MS 장비를 이용한 s-s결합 분석

단백질 구조의 안정성에 영향을 끼치는 s-s 결합은 소마트로핀 단백질 의약품에는 2개가 존재하고 있음이 알려져 있으며, s-s 결합 유무는 DTT (dithiothreitol)와 같은 환원제를 처리하면 s-s 결합이 끊어지게 되는데 DTT 처리 전후의 펩티드 변화를 분석함으로써 s-s 결합의 유무를 확인하는 분석법을 구축하였다. 소마트로핀 단백질에 존재한다고 알려져 있는 2개의 s-s 결합 유무를 확인하기 위해서 DTT 처리 전후의 펩티드 프로파일 분석을 수행하여, 펩티드 프로파일 비교분석에서 환원제 처리 후 사라지는 2개의 피크를 확인하였다(그림 8).

그림 8. LC-MS를 이용한 DTT 처리 전후의 펩티드 프로파일 비교분석

MALDI-TOF 장비를 이용한 s-s결합 분석

MALDI-TOF MS를 이용한 s-s결합 분석을 위해서는 LC-MS분석법에서와 같이 DTT를 이용한 s-s 결합의 절단 전후시료의 비교분석을 통해서 분석할 수 있다. MALDI-TOF MS는 LC-MS와 같이 질량분석 크로마토그램 결과를 통한 비교분석은 불가능하고 질량분석 스펙트럼의 패턴비교 및 DTT 처리 후 없어진 피크를 찾아냄으로써 s-s 결합의 존재 유무를 확인 할 수 있다.(그림 9)

그림 9. MALDI-TOF MS를 이용한 DTT 처리 전후 질량분석 스펙트럼비교

위에서 제시한 바와 같이 본 시험정보집에서는 두 종류의 질량분석기 즉 LC-MS와 MALDI-MS를 활용한 특성분석법을 소개하고 있다. 이 두 방법의 장단점을 비교요약하면 표 2)와 같다.

표 2. 특성분석시 질량분석기 종류에 따른 장단점 비교

	LC-MS	MALDI-TOF MS
단백질 분자량 측정시험법	컬럼 및 장비의 종류에 따라 머무름시간차이가 있음 상대적으로 정확한 결과를 가져올수 있음.	짧은 시간내에 분석이 가능함 매번 분석시 정밀한 calibration을 필요로 함 LC-MS에 비해 상대적으로 정확성이 낮음.
펩티드 프로파일 분석법	컬럼 및 장비의 종류에 따라 머무름시간차이가 있음 분석시간이 상대적으로 오래 걸림 다른 서열의 같은 분자량 펩티드 분리가능하며 불순물 정보도 확인 가능 상대적으로 분자량이 작은 펩티드의 서열분석도 가능 함	이미 서열을 알고 있는 펩티드를 빠른 시간내 분석가능 같은 분자량 다른 서열 펩티드 정보 확인 불가 matrix을 이용한 분석법으로 분자량 500da이하 펩티드 분석이 어려움 소량으로 존재하는 펩티드 분석이 어려움
펩티드 지도 분석법
s-s결합유무 및 위치 확인분석법
펩티드서열분석법

III. 재조합의약품 (소마트로핀)의 특성분석 및 검증 시험법 SOPs

1. LC-MS 장비를 이용한 분자량 측정 시험법

시료, 시약, 장치 및 프로그램

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

소마트로핀 유럽약전 표준품 (EPRS)

소마트로핀 국가표준품 (MFDS)

시약

정제수 (Mili-Q water)

n-Propanol (Burdick & Jackson)

Formic acid (Fluka)

장비 및 프로그램

Mass system: LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific.)

UPLC system: Accelar UHPLC system (Thermo Scientific)

Detection: m/z 800-2000

Data analysis: Xcalibur (Thermo Scientific)

분석조건

- Column: Acquity UPLC BEH300 C4 (2.1x100 mm, 1.7 um, Waters)

- 용출용매: A: DW (0.1 % formic acid), B: n-Propanol

- 용출속도: 400 μL/min

- 용출조건

Time(분)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	85	15
0.5	80	20
15	60	40
16	20	80
17	20	80
17.5	85	15
20	85	15

분석방법

소마트로핀 (인성장호르몬, hGH)의 표준품 시료를 각각 초 순수 3차 정제수에 녹여 단백질의 농도가 1 mg/ml 되게 제조한다.

제조된 소마트로핀 시료 5 μL를 LC-MS에 주입하여 질량스펙트럼 측정한다.

소마트로핀 해당 피크의 질량분석 스펙트럼을 확인하고, deconvolution을 수행한다.

Deconvolution을 수행한 스펙트럼에서 분자량 값을 확인한다.

<시험법 검증>

시험법 1를 10회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 특이성 평가를 실시한다.

시험법 1를 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 정확성 평가를 실시한다.

시험법1에서 조제한 시료용액을  3회 반복 주입하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차 및 상대표준편차를 계산하여 시스템 정밀성 검증을 수행한다.

각 시험자가 시험법 1를 각 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험자간 정밀성 평가를 실시한다.

시험일자 별로 시험법 1를 각 5회 반복수행하여 분석한 결과의  평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험일간 정밀성 평가를 실시한다.

각 시험기관에서 시험법 1를 각 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험실간 정밀성 평가를 실시한다.

제조사별 컬럼을 사용하여 각 3회 반복 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차를 계산하여 완건성 평가를 실시한다.

2. MALDI-TOF-MS 장비를 이용한 분자량 측정 시험법Ⅱ.

시료, 시약, 장치 및 프로그램

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

소마트로핀 유럽약전 표준품 (EPRS)

소마트로핀 국가표준품 (MFDS)

시약

Matrix: Sinapinic acid (Bruker Daltonics, #203073)

Protein calibration standard II (Bruker Daltonics, #207234)

Ground steel target plate (Bruker Daltonics, #209519)

Trifluoroacetic acid (Sigma, 302031)

장비 및 프로그램

Mass spectromet교: Ultraflex III (Bruker Daltonics)

Instrument control : Flexcontrol 3.0 (Bruker Daltonics)

Detection : m/z 6,000 ~ 50,000

Data analysis : Flexanalysis 3.0 (Bruker Datonics)

Ultrasonic cleaner (Hwashin Tech.)

분석조건

- Analysis mode : Linear mode

- Laser repetition rate : 100 Hz

- Number of shot : 800 shot

- Polarity : Positive

- Deflection : off

- Voltage

Part	Voltage
Ion Source I	25 kV
Ion Source II	23 kV
Lens	6 kV
Linear Detector	1.988 kV

분석방법

소마트로핀 (인성장호르몬, hGH)의 국제 표준품 시료와 국가 표준품 시료를 각각 초순수 3차 정제수에 녹여 단백질의 농도가 1 mg/ml 되게 제조한다.

Matrix를 20 mg/ml 되게 0.1 % TFA/70 % ACN에 녹인 후 5 분간 sonication 수행한다.

제조된 소마트로핀 용액 1 μL를 Matrix 용액 1μL와 섞어 MALDI plate 위에 점적시킨다.

상온에서 용매를 충분히 건조시킨다.

Target plate를 MALDI-TOF 질량분석기에 넣고 standard를 이용해 장비의 calibration을 수행하고 시료를 측정한다.

<시험법 검증>

시험법 2를 10회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값(AVERAGE), 표준편차(STDEV), 상대 표준편차 계산하여 특이성 평가를 실시한다.

시험법 2를 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값(AVERAGE), 표준편차(STDEV), 상대 표준편차 계산하여 정확성 평가를 실시한다.

3. 단백질 분해효소 처리 조건 최적화 시험법

시료, 시약, 시액 및 장비

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

시약

Trypsin (Rhoche, 11 418 025 001)

Trizma base (Sigma, T1503)

Urea (Fluka, 51456)

Iodoacetamide (Sigma, I1149)

Dithiothreitol (BIO-RAD, 161-0611)

Formic acid (Fluka, 06440)

CaCl2 (Sigma, C4901)

시액

6 M Urea, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

200 mM DTT (Dithiothreitol), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

200 mM IAA (Iodoacetamide), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2(pH 7.6)

Trypsin Solution (25 μg/250 μL), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

실험방법

효소처리방법 1

50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액을 이용하여 각 단백질을 1 mg/ml의 농도로 제조한다.

제조된 단백질 시료 5 μL에 1 mM CaCl2 (pH 7.6) 775 μL와 trypsin 용액 20 μL을 첨가한 후 전체 반응액이 1000 μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충용액을 첨가한다.

이를 37 ℃에서 18 시간 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소반응을 중지시킨다.

효소 반응시킨 시료의 펩티드 분석을 위해서 시료 5 μL를 LC-MS에 주입하여 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram) 측정한다.

효소처리방법 2

단백질 stock solution (5 mg/ml)을 준비한 후 6 M Urea로 1/5 희석하여 1 mg/ml 의 농도가 되도록 제조한다.

제조된 단백질 시료 5 μL에 1 mM CaCl2(pH 7.6) 775 μL와 trypsin 용액 20 μL을 첨가한 후 전체 반응액이 1000 μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충용액을 첨가한다.

이를 37℃에서 18 시간 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소반응을 중지시킨다.

효소 반응시킨 시료의 펩티드 분석을 위해서 시료 5 μL를 LC-MS에 주입하여 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram) 측정한다.

효소처리방법 3

단백질 stock solution (5 mg/ml)을 준비한 후 6 M Urea로 1/5 희석하여 1 mg/ml 의 농도가 되도록 제조한다.

제조된 단백질 시료 5 μL에 1 mM CaCl2 (pH 7.6) 775 μL와 trypsin 용액을  15 μL,  20 μL 또는 50 μL를 추가하여 단백질 시료와 trypsin 효소의 비율이 66:1, 50:1 또는 20:1이 되도록 첨가한 후  전체 반응액이 1000 μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충용액을 첨가한다.

이를 37℃에서 18 시간 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소반응을 중지 시킨다.

효소반응시킨 시료의 펩티드 분석을 위해서 시료 5 μL를 LC-MS에 주입하여 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram) 측정한다.

4. LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석 시험법

시료, 시약, 분석장비 및 프로그램

시료

효소 반응시킨 단백질 시료

시약

정제수 (Mili-Q water)

Acetonitrile (Burdick & Jackson, AH015-4)

Formic acid (Fluka, 06440)

분석장비 및 프로그램

Mass system: LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific.)

UPLC system: Accelar UHPLC system (Thermo Scientific)

Detection: m/z 300-1800, full scan mode

Data analysis: Xcalibur (Thermo Scientific)

분석조건

- Column: Acquity UPLC BEH130 C18 (2.1x100 mm, 1.7 μm, Waters)

- 용출용매: A: DW (0.1 % formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid)

- 용출속도: 300 μL/min

- 용출조건

Time(분)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	99	1
3	99	1
63	50	50
63.5	0	100
66	0	100
66.5	99	1
70	99	1

분석방법

효소 처리된 단백질 시료를 각각 5 μL 취하여 LC-MS분석을 수행한다.

LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석을 위해서 분자량 범위 m/z 300∼1800까지 full scan mode로 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram)을 측정한다.

분석조건의 분해능을 15,000∼30,000 정도로 선택하여 monoisotope 피크를 측정할 수 있도록 설정한다.

얻어진 질량분석 크로마토그램의 패턴비교분석을 통해 결과를 해석한다.

<시험법 검증>

시험법 4를 3회 반복수행하여 분석한 분자량의 평균값과 이론값의 Mass error 값을 계산하여 정확성 평가를 실시한다.

시험법 4를 수행하여 분석한 결과의 PDA 크로마토그램 상 감도가 가장 높은 5개의 펩티드 피크를 선별하여 아래의 시험법 검증을 수행한다.

시험법 4에서 조제한 시료용액을 3회 반복 주입하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차 및 상대표준편차를 계산하여 시스템 정밀성 검증을 수행한다.

각 시험자가 시험법 4를 각 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험자간 정밀성 평가를 실시한다.

시험일자 별로 시험법 4를 각 5회 반복수행하여 분석한 결과의  평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험일간 정밀성 평가를 실시한다.

각 시험기관에서 시험법 4를 각 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차 계산하여 시험실간 정밀성 평가를 실시한다.

제조사별 컬럼을 사용하여 시험법 4를 각 3회 반복수행하여 분석한 결과의 평균값, 표준편차, 상대 표준편차를 계산하여 완건성 평가를 실시한다.

5. LC-MS를 이용한 펩티드 지도 분석 시험법

시료, 시약, 분석장비 및 프로그램

시료

효소 반응시킨 단백질 시료

시약

정제수 (Mili-Q water)

Acetonitrile (Burdick & Jackson, AH015-4)

Formic acid (Fluka, 06440)

분석장비 및 프로그램

Mass system: LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific.)

UPLC system: Accelar UHPLC system (Thermo Scientific)

Detection: m/z 300-1800, full scan mode

Data analysis: Xcalibur (Thermo Scientific)

분석조건

- Column: Acquity UPLC BEH130 C18 (2.1x100 mm, 1.7 μm, Waters)

- 용출용매: A: DW (0.1 % formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid)

- 용출속도: 300 μL/min

- 용출조건

Time(분)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	99	1
3	99	1
63	50	50
63.5	0	100
66	0	100
66.5	99	1
70	99	1

분석방법

효소 처리된 단백질 시료를 각각 5 μL 취하여 LC-MS분석을 수행한다.

LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석을 위해서 분자량 범위 m/z 300∼1800까지 full scan mode로 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram)을 측정한다.

분석조건의 분해능을 15,000∼30,000 정도로 선택하여 monoisotope 피크를 측정할 수 있도록 설정한다.

얻어진 질량분석 크로마토그램의 각각의 피크에 대한 분자량을 이론적으로 생성될수 있는 펩티드의 분자량과 비교 분석한다.

아미노산서열에 기반한 생성가능한 펩티드목록을 작성하고 측정된 피크에 대한 분자량을 비교분석한 테이블을 작성한다.

6. MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석 시험법

시료, 시약, 장비 및 프로그램

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

소마트로핀 유럽약전표준품 (EPRS)

소마트로핀 국가표준품 (MFDS)

시약

Matrix: α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (Bruker Daltonics, #201344)

Peptide Calibration Standard (Bruker Daltonics, #206195)

Ground Steel Target Plate (Bruker Daltonics, #209519)

장비 및 프로그램

Mass spectrometer: Ultraflex III (Bruker Daltonics)

Instrument control : Flexcontrol 3.0 (Bruker Daltonics)

Detection : m/z 500 ∼ 5,000

Data analysis : Flexanalysis 3.0 (Bruker Datonics)

분석조건

- Analysis mode : Reflector mode

- Laser repetition rate : 66.667 Hz

- Number of shot : 800 shot

- Polarity : Positive

- Deflection : off

- Voltage

Part	Voltage
Ion Source I	25 kV
Ion Source II	21.65 kV
Lens	9.2 kV
Reflector I	26.3 kV
Reflector II	13.7k V
Reflector Detector	1.753 kV

분석방법

Matrix를  20 mg/ml 되게 0.1 % TFA/70 % ACN에 녹인 후 5 분간 sonication 수행한다.

효소처리 된 소마트로핀 용액 1 μL를 Matrix 용액 1 μL와 섞어 MALDI plate 위에 점적시킨다.

상온에서 충분히 건조시켜 준다.

Matrix 용액 1 μL를 건조된 Target plate 위에 있는 sample에 더 뿌려 준다.

상온에서 다시 충분히 건조시킨다.

Target plate를 질량분석기(MALDI-TOF)에 넣고 standard를 이용해 calibration을 수행하고 시료 분석을 진행한다

7. LC-MS/MS를 이용한 아미노산 서열분석 시험법

시료, 시약, 시액 및 장비

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

시약

Trypsin (Rhoche, 11 418 025 001)

Trizma base (Sigma, T1503)

Urea (Fluka, 51456)

Iodoacetamide (Sigma, I1149)

Dithiothreitol (BIO-RAD, 161-0611)

Formic acid (Fluka, 06440)

CaCl2 (Sigma, C4901)

Acetonitrile (Burdick & Jackson, AH015-4)

시액

6 M Urea, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

200 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

200 mM Iodoacetamide (IAA), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2(pH 7.6)

Trypsin Solution (25 μg/250 μL), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

장비 및 도구

Mass system: LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific.)

UPLC system: Accelar UHPLC system (Thermo Scientific)

Detection: m/z 300-1800, Data dependent scan

MS/MS: Collision induced dissociation (CID), 35 % energy

Data analysis: Proteome Discoverer (Thermo Scientific)

Vortex mixer (Scientific Industries, Vortex genie-2)

Heating block (Eppendorf)

초순수 제조장치 (Millipore)

분석조건

- Column: Acquity UPLC BEH130 C18 (2.1x100 mm, 1.7 μm, Waters)

- 용출용매: A: DW (0.1% formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid)

- 용출속도: 300 μL/min

- 용출조건

Time(분)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	99	1
3	99	1
63	50	50
63.5	0	100
66	0	100
66.5	99	1
70	99	1

시료제조 방법

각 단백질 stock solution (5 mg/ml)을 준비한 후 6 M Urea로 1/5 희석하여 1 mg/ml의 농도가 되도록 시료를 준비한다.

이 용액 100 μL에 200 mM DTT(50 mM Tris-HCl, pH 8.0) 5 μL을 첨가하고 상온에서 1시간동안 환원반응 시킨다.

200 mM IAA (50 mM Tris-HCl, pH 8.0) 20 μL을 처리한 후 암실에서 알킬화 반응시킨다.

200 mM DTT 20 μL을 첨가한 후 조건에서 1시간 동안 암실에서 반응시킨다.

1 mM CaCl2 (pH 7.6) 775 μL와 0.1μg/μL trypsin 용액 20μL을 첨가한 후 전체 반응액이 1000 μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충 용액을 첨가한다.

이를 37 ℃에서 18 시간동안 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다.

분석방법

효소 처리된 시료 5 uL를 주입하여 LC-MS/MS 분석을 진행한다.

LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석을 위해서 분자량 범위 m/z 300-1800까지 full scan mode로 질량분석 크로마토그램 (MS chromatogram) 측정한다.

Full scan mode의 분석조건의 분해능을 15,000-30,000 (FWHM) 정도로 선택하여 mono isotopic 스펙트럼을 측정할 수 있도록 설정한다.

펩티드의 MS/MS 분석을 위해서 Data dependent scan기능을 이용하여 MS/MS 스펙트럼을 측정한다.

펩티드의 fragmentation은 CID방식으로 수행한다.

측정된 결과로부터 펩티드의 동정은 Proteome Discoverer 1.3 (Thermo) 프로그램을 이용하여 아미노산 서열분석을 수행한다.

8. LC-MS를 이용한 s-s 결합분석 시험법

시료, 시약, 시액 및 장비

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

시약

Trypsin (Roche, 11 418 025 001)

Trizma base (Sigma, T1503)

Urea (Fluka, 51456)

Iodoacetamide (Sigma, I1149)

Dithiothreitol (BIO-RAD, 161-0611)

Formic acid (Fluka, 06440)

CaCl2 (Sigma, C4901)

시액

6 M Urea, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

200 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

200 mM Iodoacetamide (IAA), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2(pH 7.6)

Trypsin Solution(25 μg/250 μL), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

장비 및 도구

Mass system: LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific.)

UPLC system: Accelar UHPLC system (Thermo Scientific)

Detection: m/z 300-1800, full scan mode

Data analysis: Xcalibur (Thermo Scientific)

Vortex mixer (Scientific Industries, Vortex genie-2)

Heating block (Eppendorf)

초순수 제조장치 (Millipore)

분석조건

- Column: Acquity UPLC BEH130 C18 (2.1x100 mm, 1.7 μm, Waters)

- 용출용매: A: DW (0.1 % formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid)

- 용출속도: 300 μL/min

- 용출조건

Time(분)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	99	1
3	99	1
63	50	50
63.5	0	100
66	0	100
66.5	99	1
70	99	1

시료제조 방법

각 단백질 stock solution (5 mg/ml)을 준비한 후 6 M Urea로 1/5 희석하여 1 mg/ml의 농도가 되도록 시료를 준비한다.

이 용액 100 μL에 200 mM DTT(50 mM Tris-HCl, pH8.0) 5 μL을 첨가하고 상온에서 1시간동안 환원 반응을 시킨다.

200 mM IAA (50 mM Tris-HCl, pH8.0) 20 μL을 처리한 후 암실 알킬화 반응시킨다.

200 mM DTT 20 μL을 첨가한 후 조건에서 1시간동안 암실 반응시킨다.

환원 및 알킬화 반응을 진행하지 않는 시료는 200 mM DTT, 200 mM IDA 대신 50 mM Tris-HCl 버퍼를 추가하여 동일 조건에서 진행한다.

1 mM CaCl2 (pH7.6) 775 μL와 0.1μg/μL trypsin 용액 20μL을 첨가한 후 전체 반응액이 1000μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충 용액을 첨가한다.

이를 37℃에서 18시간동안 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소 반응을 중지한다.

분석방법

LC-MS 분석을 통한 s-s 결합펩티드 분석은 DTT 처리과정 유무에 따른 두가지 시료를 “LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 비교분석 시험법” 방법으로 분석을 수행하여 DTT 처리 후 시료의 질량분석 크로마토그램(MS chromatogram)상에서 사라지는 피크를 확인한다.

DTT 처리 시료의 질량분석 크로마토그램에서 사라진 피크에 해당되는 피크를 DTT 처리전 시료의 결과에서 질량분석 스펙트럼(MS spectrum)을 확인하여 예상 s-s 결합 펩티드의 분자량과 비교분석한다.

추가적인 분석이 필요할 경우 MS/MS 분석이 가능한 장비의 경우 MS/MS를 수행하여 s-s 결합 펩티드의 아미노산 서열분석이 가능하다.

9. MALDI-TOF MS를 이용한 s-s 결합분석 시험법

시료, 시약, 시액 및 장비

시료

소마트로핀 국제표준품 (NIBSC)

시약

Matrix: α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (Bruker Daltonics, #201344)

Peptide Calibration Standard (Bruker Daltonics, #206195)

Ground Steel Target Plate (Bruker Daltonics, #209519)

Trypsin (Rhoche, 11 418 025 001)

Trizma base (Sigma, T1503)

Urea (Fluka, 51456)

Iodoacetamide (Sigma, I1149)

Dithiothreitol (BIO-RAD, 161-0611)

Formic acid (Fluka, 06440)

CaCl2 (Sigma, C4901)

시액

6 M Urea, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

200 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

200 mM Iodoacetamide (IAA), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2(pH 7.6)

Trypsin Solution(25 μg/250 μL), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)

장비 및 도구

Mass spectrometer: Ultraflex III (Bruker Daltonics)

Instrument control : Flexcontrol 3.0 (Bruker Daltonics)

Detection : m/z 500 ~ 5,000

Data analysis : Flexanalysis 3.0 (Bruker Datonics)

Vortex mixer (Scientific Industries, Vortex genie-2)

Heating block (Eppendorf)

초순수 제조장치 (Millipore)

분석조건

- Analysis mode : Reflector mode

- Laser repetition rate : 66.667 Hz

- Number of shot : 800 shot

- Polarity : Positive

- Deflection : off

- Voltage

Part	Voltage
Ion Source I	25 kV
Ion Source II	21.65 kV
Lens	9.2 kV
Reflector I	26.3 kV
Reflector II	13.7k V
Reflector Detector	1.753 kV

분석방법

각 단백질 stock solution (5 mg/ml)을 준비한 후 6 M Urea로 1/5 희석하여 1 mg/ml의 농도가 되도록 시료를 준비한다.

이 용액 100 μL에 200 mM DTT(50 mM Tris-HCl, pH8.0) 5 μL을 첨가하고 상온에서 1시간동안 환원 반응을 시킨다.

200 mM IAA (50 mM Tris-HCl, pH8.0) 20 μL을 처리한 후 암실 알킬화 반응시킨다.

200 mM DTT 20 μL을 첨가한 후 조건에서 1시간동안 암실 반응시킨다.

환원 및 알킬화 반응을 진행하지 않는 시료는 200 mM DTT, 200 mM IDA 대신 50 mM Tris-HCl 버퍼를 추가하여 동일 조건에서 진행한다.

1 mM CaCl2 (pH7.6) 775 μL와 0.1μg/μL trypsin 용액 20μL을 첨가한 후 전체 반응액이 1000μL가 되도록 50 mM Tris-HCl 완충 용액을 첨가한다.

이를 37℃에서 18시간동안 반응한 후 포름산 5 μL를 첨가하여 효소 반응을 중지한다.

Matrix를  20 mg/ml 되게 0.1 % TFA/ACN(7:3)에 녹인 후 5 분간 sonication 한다.

효소반응 시료 1 μL를 Matrix 용액 1 μL와 섞어 MALDI plate 위에 점적시킨다.

상온에서 충분히 건조시킨다.

Matrix 용액 1 μL를 건조된 Target plate 위에 있는 sample에 더 뿌려 준다.

상온에서 다시 충분히 건조시킨 후 target plate를 MALDI-TOF 질량분석기에 넣고 standard를 이용해 calibration 수행 후 시료를 분석한다.

MALDI-TOF MS 스펙트럼 분석을 통한 s-s 결합펩티드 분석은 DTT 처리과정 유무에 따른 두가지 시료를 “MALDI-TOF를 이용한 펩티드 프로파일 분석 시험법” 방법으로 분석을 수행하여 DTT 처리 후 사라지는 피크의 분자량을 확인한다.

Ⅳ. 재조합의약품 (소마트로핀)의 특성분석 시험법 검증 결과

LC-MS 장비를 이용한 분자량 측정 시험법 검증 결과

평가항목	평가지표 및 기준	결과	결론
특이성	질량분석 크로마토그램상 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 0.5%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.30% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
정확성	측정 분자량의 오차범위 1Da이내의 오차와 30ppm 이내의 정확성	오차범위: ±0.595Da 정확성: 26.9 ppm	적합
시스템 정밀성	질량분석 크로마토그램상 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 0.5%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.27% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
시험자간 정밀성	질량분석 크로마토그램상 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 5%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.17% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
실험일간 정밀성	질량분석 크로마토그램상 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 2%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):1.46% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
실험실간 정밀성	질량분석 크로마토그램상 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 10%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):6.23% 분자량(RSD) : 0.006%	적합
완건성	질량분석 크로마토그램상 상대머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 15%이하 질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):10.11% 분자량(RSD) : 0.000%	적합

MALDI-TOF 장비를 이용한 분자량 측정법 검증 결과

평가항목	평가지표 및 기준	결과	결론
특이성	질량분석 스펙트럼상 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.05%이하	분자량(RSD) : 0.013%	적합
정확성	측정 분자량의 오차범위 3Da이내의 오차와 200ppm 이내의 정확성	오차범위: ±2.872Da 정확성: 129.803 ppm	적합

LC-MS를 이용한 펩티드 프로파일 분석법 검증 결과

평가항목	평가지표 및 기준	결과	결론
정확성	각 펩티드의 측정분자량 값이 이론값과의 정확성 4ppm 이하	정확성: 0.72~3.03ppm	적합
시스템정밀성	주요 펩티드의 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 0.5%이하 주요 펩티드의 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.05~0.29% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
시험자간 정밀성	주요 펩티드의 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 1%이하 주요 펩티드의 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.34~0.57% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
실험일간 정밀성	주요 펩티드의 머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 1.5%이하 주요 펩티드의 분자량 값의 상대표준편차(RSD) 0.01%이하	머무름시간(RSD):0.72~1.35% 분자량(RSD) : 0.00%	적합
실험실간 정밀성	주요 펩티드의 상대머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 15%이하 주요 펩티드의 상대 피크면적의 상대표준편차(RSD) 0.1%이하	머무름시간(RSD):3.68~11.55% 분자량(RSD) : 0.03~0.06%	적합
완건성	주요 펩티드의 상대머무름시간의 상대표준편차 (RSD) 5%이하 주요 펩티드의 상대 피크면적의 상대표준편차(RSD) 15%이하	머무름시간(RSD):2.41~4.14% 분자량(RSD) : 2.46~10.49%	적합

V. 참고문헌

의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인 적용을 위한 해설서. 식품의약품안전청. (2012.09)

대한약전 제9개정.1366-1371. (2007)

European pharmacopoeia 6.0, Somatropin, 01/2008:0951, p. 2931

U.S. Pharmacopoeia 31, Somatropin, p. 3260

Sörgel, Fritz; Lerch, Helmut & Lauber, Thomas.  Physicochemical and Biologic Comparability of a Biosimilar Granulocyte Colony-Stimulating Factor with Its Reference Product. BioDrugs. 24, 347-357 (2010)

Kinter, M.; Sherman, N.E. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, 160–164 (2000).

Michael Brad Strader, David L. Tabb, W. Judson Hervey, Chongle Pan, and Gregory B. Hurst. Efficient and Specific Trypsin Digestion of Microgram to Nanogram Quantities of Proteins in Organic-Aqueous Solvent Systems. Analytical Chemistry, 78(1), 125-134 (2006).

Wu SL, Amato H, Biringer R, Choudhary G, Shieh P, Hancock WS.Targeted proteomics of low-level proteins in human plasma by LC/MSn: using human growth hormone as a model system. J Proteome Res, 1(5),459-465 (2002).

Chong BE, Lubman DM, Rosenspire A, Miller F. Protein profiles and identification of high performance liquid chromatography isolated proteins of cancer cell lines using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 12(24), 1986-1993 (1998)

질량분석기를 이용한 유전자재조합의약품의 단백질 특성분석 시험법

발  행  일  : 2014년 6월

발  행  인  : 식품의약품안전평가원 왕진호

편집위원장  : 의료제품연구부장 강신정

편 집 위 원 : 식품의약품안전평가원 첨단바이오제품과

백선영, 김재옥, 류승렬, 엄준호, 김병철, 이보연, 박지원

경기과학기술진흥원

이종석, 김성민

발 행 부 서 : 식품의약품안전평가원 첨단바이오제품과

연  락  처  : 식품의약품안전평가원 첨단바이오제품과

전 화 번 호 : 043-719-4752∼7