일본 이화학연구소(RIKEN)는 인간 ES세포(배아줄기세포)에서 모양체 가장자리 줄기세포 니치(Niche)를 포함한 입체망막(복합망막조직)을 제작하는데 성공했다.
ES세포(배아줄기세포)나 iPS세포(인공 다능성 줄기세포)와 같은 다능성 줄기세포는 다양한 종류의 체세포로 분화하는 능력(다능성)을 가지고 있어, 시험관 내에서 의학적 및 산업적으로 유용한 세포나 조직을 생산하기 위한 제공원으로 주목받고 있으며, ES세포와 iPS세포를 목표로 하는 세포로 분화시키기 위한 분화유도법이 전 세계적으로 이루어지고 있다. 지금까지 RIKEN 연구진은 다능성 줄기세포를 효율적으로 분화시키는 ‘SFEBq법(무혈청 응집 부유 배양법)’을 개발하여 마우스와 인간의 ES세포와 iPS세포에서 대뇌, 시상하부, 하수체, 소뇌 및 망막과 같은 복합적인 신경조직을 시험관 내에서 만드는데 성공하였다. SFEBq법은 세포집단이 자발적으로 질서있는 구조를 만드는 현상(자기조직화)을 이용하여 시험관 내에서 개체발생 프로세스를 재현하는 것으로 세포가 정연하게 정렬된 삼차원 조직을 안정적이고 재현성있게 만들어낸다는 특징을 가지고 있다.
ES세포와 iPS세포를 이용해 만들어진 망막세포는 의약품이나 화학물질의 약효 및 안정성 평가와 재생의학에 응용이 기대된다. 연구진은 지금까지는 마우스의 ES세포에서 입체망막을 형성하였고, 인간 ES세포에서도 입체망막을 형성하는 법을 사용하였다. 본 연구에서는 지금까지의 입체망막 제작법을 개량할 목적으로 다음과 같은 3가지 목표를 세우고 연구를 추진하였다.
1. 선택적 망막분화유도법 개발
2. 모양체 가장자리를 가진 망막조직 제작법 개발
3. 모양체 가장자리를 가진 망막조직에서 세포의 동태 평가
먼저 선택적인 망막분화 유도법을 개발하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 종래 SFEBq 법으로 망막을 제작하는 경우 분화를 촉진하기 위해 배양액중에 동물유래 기저막 유출물을 첨가하였지만, 이 물질은 여러 가지 성분을 포함하고 있어 품질보증이 어렵기 때문에 안정성 높은 분화효율을 낼 필요가 있어 재생의료용으로는 적합하지 않아 새로운 방법이 필요했다. 연구진은 기저 추출물을 사용하지 않고 효율적으로 망막 분화를 하기 위해 SFEPq법을 개량하였다. 그 결과 분화배양 초기의 BMP(골형성인자)라고 불리는 시그널 작용물질을 첨가하여 인간 ES세포에서 효율적으로 망막조직으로 분화유도하는 법을 발견하였고, 이를 BMP법이라고 이름붙였다. ([그림 1], [그림 2]) BMP법은 기적막 추출물을 사용하는 종래의 법과 비교하면 분화유도효율이 80%로 높으며 (종래는 70%), 선택적으로 망막 분화를 유도할 수 있다는 특징이 있다.
다음으로 연구진은 모양체 가장자리를 가진 망막조직의 제작법을 개발하였다. 모양체 가장자리는 태아기 망막의 단에 존재하는 영역([그림 1])으로 그 역할은 종마다 차이가 있다. 어류나 양서류, 조류를 이용한 연구에서 모양체 가장자리는 줄기세포를 장기간 유지하는 특수한 구조(줄기세포 니치)로 망막의 성장과 재생에 공헌한다고 알려져 있다. 한편 포유류를 사용하는 연구에서는 태아기 모양체 가장자리의 역할이 명확하기 않으며 줄기세포가 존재하는지 존재하지 않는지 조차 발생생물학자 사이에서도 의견이 엇갈린다. 특히 인간의 모양체 가장자리는 연구를 위한 조직의 확보가 어려워 그 연구가 거의 진행되지 않았다. 모양체 가장자리의 특성, 특히 줄기세포의 존재여부를 해명하면 각각 동물의 눈 형태나 크기가 어떻게 결정되는지를 이해할 수 있다.
이에 연구진은 인간 ES세포를 모양체 가장자리를 가진 입체망막으로 분화유도하고자 하였다. 모양체 가장자리는 태아기의 망막(신경망막)과 망막생소상피(RPE)의 경계영역을 형성한다. ([그림 1]) 이에 우선 신경망막과 RPE가 공존하는 복합망막조직 제작법을 검토하였다. 지금까지 연구에 의해 신경망막 분화 및 유지에는 FGF 시그널이, 또 RPE 분화 및 유지에는 Wnt 시그널이 중요한 역할을 담당하고 있다고 알려져 있다. 연구진은 인간 ES세포에서 BMP법으로 제작한 망막조직을 우선 FGF시그널의 저해제와 Wnt시그널의 작동제를 포함한 배양약에서 배양하여 RPE로 분화시킨 후 다시 신경막막을 유도하는 조건으로 배양하여 신경망막으로 되돌려 신경망막과 RPE가 공존하는 복합망막조직 형성에 성공하였다. 이 방법을 일단 RPE로 전환한 세포를 다시 신경망막으로 전환시킨다는 점에서 ‘되돌림법’으로 이름붙였다. ([그림 3]) 이 방법으로는 복합망막조직을 40%정도의 효율로 안정적으로 제작할 수 있게 되었다. 되돌림법으로 제작한 복합망막조직을 60일간 계속 배양하면 신경망막과 RPE가 각각 성장하여 식물의 그루터기와 비슷한 형태가 된다. 이 복합망막조직을 이용하여 신경망막과 RPE의 경계영역에서 태아의 모양체 가장자리와 비슷한 특징을 가진 조직을 형성시켰다. 이는 인간 ES세포의 신경망막과 RPE를 동시에 유도하는 것으로 자기조직화에 의해 양자의 경계영역으로 모양체 가장자리가 형성한다는 것을 시사한다. 한편 이 모양체 가장자리를 포함한 조직을 90일간 배양하면, 시세포 전구세포가 풍부하게 생성된다는 것을 확인하였으며, 150일간 배양할 경우 분화를 진행한 시세포가 생산되는 것을 확인하였다. 또한 이 복합망막조직을 종래의 방법과 비교해보면 태아망막과 매우 비슷한 규칙적 입체구조(연속상피구조)가 높은 빈도로 포함되어 있다는 것을 확인하였다.
마지막으로 모양체 가장자리를 포함한 입체망막의 성질을 검토하였다. 우선 망막 줄기세포의 수를 조사하여 모양체 가장자리에 줄기세포가 풍부하게 포함되었는지 확인하였다. 그리고 모양체 가장자리에 포함된 줄기세포가 빛을 받는 시세포나 뇌의 시각정보를 전달하는 신경조절세포로의 분화태를 가지고 있다는 것을 확인하였다. 또한 세포를 핵산아날로그에서 동태를 분석한 결과 모양체 가장자리 세포는 활발하게 증식하여 모양체 가장자리 가까이에서 입체망막을 성장시키는 세포가 된다는 것을 발견하였다. 그 결과 모양체 가장자리가 줄기세포 니치의 기능을 하면서 입체망막이 시험관 내에서 성장하는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
본 연구를 통해 연구진은 선택적이고 안정성이 높은 망막분화 유도법을 확립하였고, 되돌림법으로 모양체 가장자리를 포함한 복합 망막조직 제작에 성공하였다. 또한 모양체 가장자리가 줄기세포 니치로 기능하면서, 입체망막이 시험관내에서 성장할 수 있다는 것을 확인하였다. 지금까지 인간 망막의 성장과정은 밝혀지지 않았지만, 본 연구로 인해 망막의 형성과정을 밝혀낼 수 있게 되었다. 또한 줄기세포 니치형성의 메커니즘도 지금까지 알려지지 않았지만, 이번 실험으로 시험관 내 줄기세포 니치를 형성하는 배양계를 확립하게 되었다. 향후 이 배양계를 이용하여 줄기세포로 줄기세포를 만드는 분자기재를 해명할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구성과는 2월 19일자 ‘Nature Communications’에 게재된 논문 ”Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue”에서 자세하게 확인할 수 있다.
