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학술

벌집 성분으로 통풍 치료하는 메커니즘 최초 발견

'Scientific Report’ 12월 9일자에 게재

벌집의 프로폴리스 성분인 CAPE(Caffeic acid phenethyl este)
Targeting ASC in NLRP3 inflammasome: a novel strategy to treat acute gout



벌집의 성분으로 통풍을 치료하는 새로운 해법이 발견되었다. 한국연구재단(이사장 조무제)은 이주영 교수(가톨릭대) 연구팀이 벌집의 프로폴리스 성분인 CAPE(카페인산 페네틸 에스터)이 통풍의 주요 메커니즘인 염증조절복합체*의 하위 단백질에 직접적으로 결합하는 것을 최초로 밝혀 통풍을 치료하는 새로운 가능성을 제시했다고 밝혔다. 
    
* CAPE(Caffeic acid phenethyl este) : 벌집에서 추출, 분리된 플라보노이드 계열의 물질
     
* 염증조절복합체 (inflammasome) : 통풍의 주요 원인물질인 요산염 결정을 인지, 수용하여 세포에 염증성 사이토카인의 분비를 일으키는 단백질 복합체 

통풍은 관절 내에 요산이 침착되면서 발생하는 질환이다. 국내 진료환자 수는 2011년 24만명으로 매년 증가 추세다. 하지만 현재 치료제는 일시적 통증 완화에 그치고 있어 근본적인 치료제 개발이 시급하다. 

연구팀은 벌집의 구성성분인 프로폴리스에 많이 함유된 CAPE이 요산염 결정으로 유도된 급성통풍 실험쥐 모델에서 부종을 완화시키며 통풍에서 주요하게 작용하는 사이토카인*의 발현을 억제한 것을 밝혔다. 
     
*사이토카인 : 세포 사이의 신호 전달을 매개하는 단백질 인자의 총칭

이 연구결과는 광범위하게 염증을 억제하는 기존의 비스테로이드소염제 (NSAIDs)의 한계를 넘어선 것이다. 기존의 소염진통제는 통풍의 근본적인 치료가 아니라 일시적인 통증의 완화제로써 낮은 치료효과, 여러 가지 부작용 등이 따른다. 

하지만 이 연구는 CAPE의 경구투여가 통풍의 직접적인 작용 메커니즘인 염증조절복합체의 형성을 억제함으로서 근본적인 치료의 길을 열었다. CAPE이 염증조절복합체 형성의 중요한 연결고리인 ASC 단백질에 직접적으로 결합함으로써 복합체 형성을 차단함을 세계 최초로 밝혔다.통풍유발물질인 요산결정을 인지하는 NLRP3 염증조절복합체의 형성 자체를 방해함으로써 근본적인 통풍의 치료에 효과적임을 발견한 것이다. 

이주영 교수는 “이 연구성과는 단순히 광범위한 염증 치료제를 사용하던 기존 통풍 치료제의 한계를 넘어서 6년여의 오랜 연구 끝에 천연물 성분으로 통풍을 치료할 수 있는 직접적 원인물질의 작용 메커니즘을 찾은 것이다. 통풍치료를 위한 신규 약물 발굴 및 최적의 치료제 도출에 기여할 것으로 기대된다.”라고 연구의 의의를 설명했다. 

이 연구성과는 미래창조과학부·한국연구재단의 기초연구사업(개인연구)의 지원으로 수행되었으며, 네이처 자매지인 사이언티픽 리포트(Scientific Report)’ 12월 9일자에 게재되었다. 




논문의 주요 내용

논문명, 저자정보 

- 논문명 : Targeting ASC in NLRP3 inflammasome: a novel strategy to treat acute gout
   
- 저자 정보 : 이주영 교수(교신저자, 가톨릭대), 이혜은(공동 제1저자, 가톨릭대), 양갑식 박사(공동 제1저자, 가톨릭대), 김남두 박사(대구경북첨단의료산업진흥재단), 정성근(부산대), 정연진 교수(부산대), 최재영(영남대), 박현호 교수(영남대)


논문의 주요 내용 

 1. 연구의 필요성
  
통풍은 재발율이 높으며 주로 발에서 시작해 관절 곳곳을 공격하는 통풍은 극심한 통증과 함께 관절이 붓고, 혹이 생기며 뼈가 변형되기도 한다. 중증의 강렬한 통증을 동반하는 통풍은 지난 20년 동안 서구 식단의 보급으로 특히 40대 이상 뿐만 아니라 최근 젊은층에서도 발병율이 급속도로 증가하고 있다.
 
그러나 현재 사용되는 약물의 임상적 사용은 비 스테로이드성 소염진통제 (NSAIDs)로 다소 제한적이며 여러 부작용을 동반하게 될 뿐만 아니라 이 약물들은 통풍을 치료하지 못하고 일시적인 통증 완화만을 제공한다. 따라서 발병 메커니즘에 관여하는 염증 메커니즘을 연구하고 그 치료에 보다 효과적인 약제를 개발하는 것이 시급하다.
         
* 비스테로이드성 소염진통제(NSAIDs) : 진통, 해열, 항염증 작용을 나타내는 약물 중 스테로이드가 아닌 약물. 대표적으로 이브푸로펜, 아스피린 등이 있다.
         
* 스테로이드제 : 콜티존계의 부신피질호르몬제로서 강력한 항염증, 항알레르기 작용을 하므로, 여러 염증성 질환 뿐 아니라 의료 분야에서 광범위하게 사용되고 있다.


 2. 연구내용 
  
통풍은 관절 및 관절 주위 조직에 요산 결정이 침착됨으로써 유발된다. 최근 요산 결정에 반응하여 염증 신호를 생성하는 NLRP3 수용체가 확인되었다. 이는 요산 결정을 포함한 미생물의 침입과 내인성 위험 신호를 검출한다. 
         
* NLRP3 (NOD-like receptro family, pyrin domain contating 3) : 세포질내에 존재하는 면역의 시작으로 외부 물질이나 생체내에 위험 신호들을 인지하여 염증반응을 일으키는 역할을 한다.
         
* 수용체 : 특정물질 또는 물리적 자극을 수용하여 세포에 응답을 일으키는 단백질. 
  
NLRP3 수용체가 요산 결정을 인지하면 3가지의 단백질이 결합하여 염증조절복합체(inflammasome)를 형성하게 되어 염증성 사이토카인을 분비하여 염증반응을 유도하게 된다. 이로 볼 때 면역학적 관점의 통풍 치료는 염증조절복합체의 결합을 제어하여 염증반응을 최소화 하는 것이 중요하다. 
         
* 염증조절복합체 : 수용체가 위험물질을 인지하게 되면 하위 단백질인 ASC가 결합하게 되고, 이어서 효소인 Caspase-1가 결합하여 염증성 사이토카인 IL-1β를 활성화 시킨다. 위의 3가지 단백질이 복합체를 이루어 결합함으로써 체내 염증반응을 일으키게 된다.  


NLRP3 수용체의 작용 메커니즘을 CAPE이 직접적으로 억제함에 따라 요산염 결정으로 유도된 급성통풍 동물모델에서 부종을 완화하고 염증성 사이토카인을 매우 높은 억제효과로 감소시키는 것을 밝혔다. 


3. 연구 성과
 
벌집의 구성성분인 프로폴리스에 많이 함유되어있는 CAPE이 ASC 단백질에 직접적으로 결합함을 세계 최초로 밝혔다. 이로써 통풍의 유발물질 요산 결정을 인지하는 NLRP3 염증 조절복합체를 이루는 것을 방해하여 근본적인 통풍의 치료에 효과적임을 밝혔다.
  
향후 ASC를 억제할 수 있는 신규 약물의 발굴 및 치료제의 최적화 도출은 실질적 통풍 등 염증성 질환 치료제 개발에 기여할 것으로 기대된다. 




연 구 결 과  개 요


 1. 연구배경

통풍은 고요산혈증 환자에서 주로 족부관절에 요산이 침착되어 이로 인해 염증성 관절염이 일어나는 질병이다. 방치할 경우 심한 골관절 파괴 및 변형등 관절 염증에만 국한되는 것이 아니라 고혈압이나 당뇨와 같은 대사질환, 심근경색, 협심증이나 중풍과 같은 심혈관계 질환위험까지 높여 사망에도 초래할 수 있는 매우 위험한 질환이다.
 
국내의 경우 실 진료환자수가 2001년 8만2천명에서 2005년 13만7천명, 2008년 19만5천명, 2011년에는 24만명으로 나타나 연평균 13%씩 증가하고 있는 것으로 나타났다(출처: 2012년 7월 10일 건간보험공단 건강보험정책). 통풍에 의한 건강보험 진료비 역시 해마다 늘어나 2001년 125억원에서 2005년 198억원, 2008년 317억원으로 나타나, 2008년 통풍에 의한 건강보험 진료비는 2001년 대비 2.5배 이상으로 나타났다. 그러나 현재 치료제로 사용되는 약물은 광범위한 진통 소염제로써 일시적 통증완화에 그칠 뿐 근본적인 메카니즘에는 관여하지 못한다. 따라서 통풍의 메커니즘에 근본적인 치료제가 시급한 상황이다. 
  

 2. 연구내용

대사 최종 산물인 요산결정이 관절의 활액막, 연골, 연골하골 및 관절주위 조직과 피하조직에 침착하여 통풍결절을 형성하여 염증과 통증을 유발한다. 침착된 요산결정은 체내의 위험물질로 작용하여 면역반응을 일으키게 된다. 요산결정을 우선적으로 인지하는 것은 수용체인 NLRP3 이고 NLRP3가 요산결정을 인지하게 되면 하위 단백질로 ASC가 결합하게 되고 이어서 Caspase-1 효소가 결합하여 최종적으로 NLRP3 염증조절복합체가 형성된다. 이를 조절하는 것이 통풍치료의 새롭고 효과적인 치료 전략이 될 것이다.

벌집의 구성성분인 프로폴리스에 많이 함유된 플라보노이드 물질인 CAPE은 항산화와 항염증 작용이 알려져 있다. CAPE이 통풍치료에 효과적인 것을 마우스 동물모델을 통해 확인하였다. 

CAPE을 마우스에게 경구투여 한 후, 마우스 발 조직에 통풍의 원인 물질인 요산결정을 대표하는 물질을 직접적으로 주사하여 통풍의 염증반응을 유도한 후 치료효과를 확인하였다.  

통풍의 원인 물질인 요산결정을 대표하는 물질로 유도된 마우스 통풍성 염증 모델 발바닥 조직에서 염증성 사이토카인이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 통풍성 염증으로 인해 유도된 NLRP3 염증조절복합체를 억제함으로 염증작용을 억제하였다. 이로써 통풍치료에 효과적이라는 것을 밝혔다.

NLRP3 염증조절복합체를 이루는 3가지 단백질 중 CAPE의 작용점을 하나씩 짚어가며 ASC가 타깃이 됨을 확인하였다. 


3. 기대효과

이 연구는 CAPE이 통풍질환에 원인 기전인 NLRP3 염증조절복합체에 직접적으로 관여하여 새로운 통풍의 치료 전략 개발에 중요한 학문적 자료를 제공할 것이다. 

NLRP3 염증조절복합체 중 하위 단백질인 ASC에 직접적으로 결합하는 물질은 세계 최초의 발견이다. 이는 통풍뿐만 아니라 염증성 대사질환에 치료제로의 개발 가능성을 제시할 수 있다. 

NLRP3 염증조절복합체의 활성 억제를 통한 통풍제어 치료제의 개발은 아직까지 세계적으로도 시도되지 않은 독창적인 방법이다. 이 연구의 성공적 수행을 기반으로 한 새로운 통풍 억제제 개발은 국내의 선도적인 시작으로 원천기술을 먼저 확보하여 국외에까지 미치는 경제적 효과가 매우 클 것으로 기대된다. 



★ 연구 이야기 ★


□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

바람만 스쳐도 아프다는 통풍에 직접적인 치료제는 없고, 발병률은 늘어나고 있다. 염증제어 연구를 중심적으로 하고 있는 우리 실험실에서 염증성 질환인 통풍의 근본적인 원인을 제어하는 치료제를 개발 할 수 있을지 확인하고자 시작하게 되었다. 


□ 연구 전개 과정에 대한 소개

이 연구는 가톨릭대 이혜은 박사과정 학생, 양갑식 연구교수가 주도하여 실험을 진행하였다. 마우스의 발바닥에 통풍유발 물질을 주사하여 통풍 동물실험에서 CAPE의 치료 개선효과가 있음을 발견한 수 이의 세포 메커니즘을 규명하는 실험을 진행하게 되었다. CAPE이 통풍의 주요 기전인 염증조절복합체의 형성을 억제하여 통풍의 염증반응을 개선함을 확인하였다. 이를 바탕으로 염증조절복합체에 관여하는 단백질에 CAPE이 결합한다는 정확한 메커니즘을 규명하였다. 


□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

연구 초기에는 우리 실험실에서 아직 설계되지 않은 동물실험 모델을 구축하는 것이 어려웠다. 정말 작은 마우스 발바닥에 통풍유발 물질을 주입하는 것은 매우 민감한 실험이어서 잘못하여 마우스가 죽는 경우도 있었다. 실험을 진행하면서 점점 노하우를 찾게 되었고, 성공적으로 실험을 진행할 수 있었다. 


□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

광범위한 염증 치료제인 진통소염제의 치료제와 달리 직접적으로 통풍의 원인 메커니즘에 작용하여 부작용은 최소화 하고 치료 효과는 극대화할 수 있는 새로운 치료 전략이다. 


□ 꼭 이루고 싶은 목표와 향후 연구계획은?

향후 연구계획은 선천면역체계가 통풍 뿐 아니라 다양한 대사 질환에 중요하게 작용하는 메커니즘을 규명하는 것이다. 이를 통해 기초연구에 원천적인 기술을 확보하여 질병치료에 새로운 연구전략을 제시하고 싶다.


□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

급성통풍 모델이기 때문에 염증의 개선 지표로써 통풍성 염증이 유도되어 두꺼워진 쥐의 발 두께를 유발 24시간 내에 시간대별로 측정하여 치료 효과를 확인한다. 이 때는 밤을 새면서 1시간 혹은 3시간 단위로 실험한 것이 기억에 남는다. 



용 어 설 명


1. 사이언티픽 레포트 (Scienrific Report) 誌
○ 종합과학 분야 세계적 권위의 학술지이며 ‘Nature publishing group’의 자매지이다. 


2. CAPE
○ CAPE (Caffeic acied phenethyl ester) 벌집의 주요 성분인 프로폴리스에 함유되어 있는 플라보노이드계열의 물질이다. 


3. 사이토카인 (cytokine)
○ 세포 사이의 신호 전달을 매개하는 단백질 인자의 총칭. 림프구가 분비하는 림포카인, 대식세포에서 유래하는 모노카인, T세포가 분비하는 인터류킨 등이 있다. 이들은 표적 세포의 수용체와 결합하여 세포 내의 다양한 활성화 메커니즘을 발현시킨다. 그 발현으로 인체에서는 면역 반응, 항암 작용, 항바이러스 작용, 세포의 증식·분화의 조절 등이 일어난다. 
 

4. NLRP3 염증조절복합체 (inflammasome)
○ 우리 몸의 면역 세포는 인터루킨-1베타(IL-1beta)를 생성, 분비하기 위해 염증조절복합체(inflammasomes)로 불리는 분자기제를 운용하고 있다. 복합 단백질 결합체인 염증조절복합체는 대부분 수용체, 결합 매개 단백질 ASC, 작용기인 Caspase-1의 3가지 주요 단백질의 다수 결합으로 구성된다. 염증조절복합체 가운데 가장 다양한 기능을 갖고 있는 NLRP3는 우리 몸에 실리카나 석면 혹은 콜레스테롤 미세결정체 같은 독성물질과 작은 입자들이 들어와 자극을 받으면 인터루킨-1베타를 분비하게 된다. 


5. ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)
○ 염증조절복합체는 일반적으로 하위 매게 단백질인 ASC와 결합하여 완성된다. 이 단백질은 세포사멸에 관련되어 있는 단백질로 알려져 있다. 


6. Caspase-1
○ 염증조절복합체의 형성에서 작용기로써 역할하고 활성화 된 효소 Caspase-1은 염증성 사이토카인 인터루킨-1베타를 활성화 시키게 된다. 




그 림 설 명

                 

(그림 1) 요산염 성분(MSU)으로 유도한 통풍 모델에서 CAPE의 경구투여를 통한 급성통풍의 개선효과
     
동물모델에서의 시간대별 쥐의 발 두께를 측정하였고 (A), 최종 쥐의 발의 사진과 조직염색을 확인하였다(B). B의 조직염색을 확대 하여 세포의 변화를 관찰하고 (C), 발바닥 조직에서 호산구의 활성을 측정하였다 (D). 야생형 마우스와 NLRP3 결핍된 마우스 비교를 위한 실험으로 마우스 발바닥 조직 내 면역학적블로팅을 측정하였다(E). A~D와 동일한 마우스 발바닥 조직에서 염증조절복합체의 억제를 면역학적 블로팅*으로 확인하고 (F), Caspase-1의 활성을 측정하고 (G), 통풍관련 주요 사이토카인 인터루킨 –1베타(IL-1β), 인터루킨–18(IL-18), 티엔에프-알파(TNF-α)의 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)*를 측정한 결과이다 (H-J). 
      
*면역학적 블로팅 : 젤 상의 미량 단백질을 멤브레인에 전기영동법으로 옮기고 그들의 항체와 결합시켜 검출하는 기법 
      
*효소결합 면역흡착 분석법 : 효소를 표식자로 하여 항원항체반응을 이용한 미량 분석기술 


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