패혈증 예방 및 치료제 개발 기대
Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for efficient LPS recognition and transfer
미래창조과학부(장관 최양희)는 국내 연구진이 패혈증의 원인 물질인 박테리아 내독소*가 우리 몸 안에서 어떻게 인식되고, 전달되는지를 밝힘으로써 박테리아 내독소에 의한 선천성 면역반응의 활성화 메커니즘을 처음으로 규명했다고 밝혔다.
*내독소 : 그람음성균에 속하는 세균들의 세포외벽에 존재하는 독성 분자. 선천성 면역반응을 활성화시키며 다량의 내독소는 세포독성 및 패혈증을 유발함.
패혈증*은 감염에 의해서 과도하게 활성화된 면역반응에 따른 전신성 염증반응 증후군으로 주요 원인물질이 박테리아 내독소이다. 박테리아 내독소가 생체 내 단백질로 전달되는 분자메커니즘을 밝혀냄으로써 내독소가 전달되는 길목을 차단해 패혈증을 치료할 수 있는 새로운 가능성이 제시되었다.
*패혈증 : 미생물에 감염되어 전신에 염증 반응이 나타나는 상태. 패혈증 쇼크 환자의 치사율은 30～70%에 달하지만 증상완화 이 외의 근본적인 치료법이 아직 없는 상태임.
김호민 교수(한국과학기술원)․윤태영 교수(연세대) 연구팀은 미래창조과학부 ․한국연구재단 기초연구사업(개인연구, 집단연구), IBS 나노의학연구단의 지원으로 연구를 수행했으며, 이 연구는 면역학 분야 국제 학술지이며, 셀(Cell) 자매지인‘이뮤니티 (Immunity)’12월 13일자에 게재되었다.
o 논문명과 저자 정보는 다음과 같다.
- 논문명 : Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for efficient LPS recognition and transfer
- 저자 정보: 김호민 교수(교신저자, 한국과학기술원), 윤태영 교수(교신저자, 연세대 IBS), 류제경 박사(제1저자, 한국과학기술원), 김수진 박사(제1저자, 한국과학기술원)
□ 논문의 주요 내용은 다음과 같다.
1. 연구의 필요성
그람 음성균 세포외막에 존재하는 내독소는 생체 내 LBP, CD14 단백질을 통해 면역세포 표면의 세포수용체 TLR4-MD2로 전달되어 선천성 면역 반응을 활성화시키는 것으로 알려져 있었다.
*LBP : 간세포에서 주로 만들어서져 혈액에 존재하며, 박테리아 내독소를 선택적으로 인식하여 CD14로 빠르게 전달해 주는 단백질
*CD14 : LBP로부터 전달받은 내독소 한 분자를 TLR4-MD2가 인지할 수 있도록 전달해주는 단백질로 혈액 내 존재하거나 세포 표면에 존재함.
*TLR4-MD2 : 면역세포 및 주요 세포막에 존재하는 세포수용체로서 내독소와 결합하게 되면 단백질의 구조적 변화 (이형체 형성)를 통해 선천성 면역반응을 활성화시키는 단백질복합체
감염에 의한 혈액 내 내독소 다량 유입은 고열, 혈압저하, 장기손상 등 과도한 염증반응의 결과인 패혈증으로 이어질 수 있지만, 내독소 인식 및 전달 관련 구체적인 분자 메커니즘이 밝혀져 있지 않아 패혈증 치료제 개발에 한계가 있었다.
2. 연구 내용
단분자 형광기법*과 바이오 투과전자현미경*을 활용하여 마이셀(Micelle) 형태로 존재하는 내독소 표면에 막대 모양의 LBP가 결합하여 내독소를 인식하고, 여기에 CD14가 빠르게 결합하여 내독소 한 분자를 가져간 후 면역세포 수용체인 TLR4-MD2와의 상호결합을 통해 건내 주는 내독소 인식 및 전달메커니즘을 총체적으로 보여주었다.
*단분자 형광기법 : 단백질에 부착한 형광을 활용하여 단백질 각각 분자의 동적인 움직임을 작은 칩 위에서 관찰하는 최신 생물리학 기술
*바이오 투과전자현미경 기법 : 투과전자현미경 속에 정제된 단백질 샘플을 넣고 사진을 찍은 후 컴퓨터를 활용한 이미지 프로세싱을 통해 단백질의 2차원 및 3차원 구조를 규명하는 첨단기술
박테리아 내독소와 정제된 LBP 단백질을 혼합하여 바이오투과전자현미경으로 사진을 찍은 후 각각의 분자의 모양을 컴퓨터를 활용한 이미지 프로세싱을 통해 분석함으로써 내독소와 결합한 LBP 단백질 구조를 최초로 규명하였다. 특히 막대모양의 LBP 단백질이 그들의 N-도메인 끝을 통해 내독소 마이셀 표면에 결합함으로써 박테리아 내독소만을 특이적으로 인식하는 것을 발견하였다.
연구팀은 박테리아 내독소에 형광을 부착시킨 후 내독소 항체를 활용해 유리슬라이드 표면에 코팅시키고, LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질들을 흘려주면서 박테리아 내독소, LBP, CD14, TLR4-MD2 분자 하나하나의 동적인 움직임을 실시간으로 관찰하는 단분자 형광 시스템을 최초로 구축하였다. 이를 통해 박테리아 내독소 표면에 결합한 LBP 단백질로부터 CD14 단백질이 내독소 한 분자만을 반복적으로 가져간 후 빠르게 TLR4-MD2로 전달함으로써 선천성 면역의 세포신호전달을 활성화 시키는 분자메커니즘을 최초로 규명하였다.
또한 마우스 면역세포인 수지상세포를 활용하여 첨단 생물물리학적인 기법을 통해 제시한 분자메커니즘이 생체 내에서 내독소를 인식하여 면역반응을 유발하는 핵심 메커니즘을 검증하였다.
3. 연구 성과
기존의 실험방법으로 접근이 어려웠던 LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질들 간의 동적인 상호작용을 최신 첨단 실험기법을 통하여 분자수준에서 규명함으로써 생체 내 내독소 인식 및 전달메커니즘을 규명하였다.
연구 방법 및 결과는 박테리아 감염에 의한 선천성 면역 연구에 새로운 방향을 제시할 것이며 특히 이 연구에서 규명한 분자적, 구조적 지식들은 패혈증 발병메커니즘 연구 및 치료제 개발에 적극 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
김호민 교수는“이 연구성과는 박테리아 내독소가 생체 내 단백질들의 동적인 상호작용에 의해 면역세포로 전달되는 일련의 과정들을 분자수준에서 최초로 밝힌 것이다. 박테리아 내독소 인식 및 전달메커니즘 이해를 통하여 선천성 면역 유발 메커니즘 이해뿐만 아니라, 패혈증 예방 및 치료제 개발에 기여할 것으로 기대된다”라고 연구의 의의를 설명했다.
연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
우리 몸의 면역체계는 크게 선천성 면역과 적응성 면역으로 분류된다. 이 중 선천성 면역은 박테리아나 바이러스에 감염되었을 때 초기에 빠르고 효과적으로 우리 몸이 대응하기 위해 활성화되는 면역반응이다.
내독소 (endotoxin)라고도 불리는 그람음성균의 외막성분인 지질다당류 (Lipopolysacharride, LPS)은 선천성 면역반응을 활성화시키는 주요 원인물질이다. 하지만 박테리아 감염 및 급격한 증식에 따라 내독소가 혈액 내 다량 존재하게 될 경우 오히려 과도한 면역반응을 일으켜 발병율과 치사율이 매우 높은 패혈증으로 발전될 수도 있다.
내독소가 혈액 내 유입되면 생체 내 두 단백질 (LBP와 CD14)이 소량의 내독소를 신속히 인지하고, 효과적으로 내독소를 면역세포 표면의 TLR4-MD2 수용체로 전달하여 선천성 면역반응을 활성화시키게 된다. 그러므로 내독소 인식과 전달과정의 이해는 내독소에 의한 면역반응 유발 메커니즘 뿐만 아니라 패혈증의 치료전략 수립을 위해서 매우 중요하다.
2. 연구내용
지난 2~30년간 단백질결정학 방법을 통한 LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질들의 3차 분자구조 규명 및 다양한 생화학적 연구방법들을 이용하여 내독소 인식 및 전달 관련 많은 연구가 이루어져 왔다. 하지만 내독소 인식 및 전달은 매우 빠르고 동적인 단백질 상호작용에 의해 일어나기에 연구에 많은 어려움을 겪어 왔다. 이 연구에서는 최신 바이오투과전자현미경 기법과 단분자 형광기법을 이용하여 이러한 기술적 한계를 극복함으로써 LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질들의 상호작용에 의한 박테리아 내독소 인식 및 전달과정의 핵심 분자메커니즘을 규명하였다.
특히 이 연구에서는 첨단기술인 바이오투과전자현미경 기법을 활용하여 각각의 분자의 모양을 분석함으로써 박테리아 내독소/LBP 복합체 구조를 최초로 규명하였다. 막대모양의 LBP 단백질이 그들의 N-도메인 끝을 통해 내독소 마이셀 표면에 결합함으로써 박테리아 내독소만을 특이적으로 인식하는 것을 발견하였다.
이 연구에서는 동적인 단백질 상호작용을 실시간으로 모니터링하고 정량화할 수 있는 단분자 형광 시스템을 새롭게 구축하였다. 이를 통해 마이셀 형태로 존재하는 박테리아 내독소의 표면에 결합한 LBP 단백질의 C-도메인과 땅콩모양의 CD14 단백질이 정전기적 결합을 통해 빠르게 박테리아 내독소 한 분자만을 가져가는 동적인 상호작용을 규명하였다. 또한 하나의 LBP 단백질에 여러 CD14 분자가 붙었다 떨어졌다를 반복하면서 박테리아 내독소를 계속하여 하나씩 가져가는 분자메커니즘도 규명하였다.
다양한 TLR-MD2 돌연변이들을 제작하여 유리슬라이드에 부착시킨 후 CD14로부터 전달받는 박테리아 내독소 분자의 움직임을 구축한 단분자 형광 시스템을 통해 관찰함으로써 CD14와 TLR4의 특정 부위의 상호결합이 내독소가 CD14로부터 TLR-MD2로 전달되는데 핵심부위임을 규명하였다.
또한 마우스 면역세포인 수지상세포에 내독소 전달 길목을 차단하는 LBP 돌연변이를 처리하였을 때 박테리아 내독소에 의해 유도되는 선천성면역 활성이 현저히 억제됨을 확인함으로써 패혈증 치료제 개발을 위한 신규 전략을 선도적으로 제시하였다.
3. 기대효과
그람음성균의 내독소가 LBP와 CD14를 거쳐 TLR4-MD2로 전달되는 핵심 분자메커니즘을 규명함으로써 박테리아 감염에 따른 선천성면역 관련 연구를 선도할 것으로 기대된다.
또한 박테리아 감염에 따른 패혈증 발병기전 연구와 치료제 개발에 활용될 수 있는 분자적, 구조적 기초지식을 제공하였다.
단백질의약품 제약 산업계의 중요 이슈인 내독소의 효과적인 제거를 위해서도 이 연구의 내독소 인식 메커니즘이 활용될 수 있을 것이다.
마지막으로 이 연구의 첨단 연구기법들은 향후 선천성 면역 관련 다양한 동적인 단백질 상호작용을 이해하는데도 활용될 수 있을 것이다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
치사율이 높기 때문에 발병 후 빠르게 대처해야 하는 패혈증의 원인물질인 내독소의 생체 내 전달과정을 분자수준에서 이해하고자 함.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질들과 내독소와의 상호결합을 투과전자현미경기법 및 단분자 형광기법으로 분석함으로써 이들 상호작용에 핵심적인 아미노산들을 동정함. LBP에 의해 내독소가 CD14로 전달되는 역동적인 과정은 실시간 단분자 형광 기법으로 분석하였고, 단백질 결정학으로 규명하기 어려운 내독소, LBP, CD14 간의 복합체 구조는 바이오투과전자현미경 기법으로 규명함.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
내독소 전달에 필요한 LBP, CD14, TLR4-MD2 단백질 간의 동적인 상호작용은 기존의 실험방법으로 추적하기에 어려움이 많음. 따라서 기존에 존재하지 않는 새로운 단분자 형광 assay법을 모든 경우에 개발하여야 했음.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
바이오투과전자현미경기법과 단분자형광현미경기법을 이용하여, 박테리아 내독소가 인식되고 면역세포로 전달되어 선천성 면역을 활성화시키는 분자기전을 최초로 규명함
□ 꼭 이루고 싶은 목표와 향후 연구계획은?
다양한 패혈증 관련 단백질들의 추가적인 구조연구를 통해 폭넓은 선천성 면역 조절 이해. 이 연구에 기반한 새로운 패러다임의 패혈증 치료제 개발
용 어 설 명
1. 이뮤니티 (Immunity)
○ 셀 출판사(Cell press)가 발행하는 셀(Cell) 자매지. Impact factor 는 2015년 기준 24.082. 면역학 분야의 세계 최고 학술지.
2. 박테리아 내독소 (LPS)
○ 그람음성균 (대표적으로 대장균)의 외막에 존재하는 지질다당류. 사람을 비롯한 여러 고등 진핵생물에서 선천성 면역을 유도하는 주요 원인 물질임. 항생제에 처리에 의해 박테리아가 죽더라도 그들의 세포막 성분이 우리 몸 속에서 완전히 제거되기 전까지 독성을 나타내므로 내독소라고 불려짐.
3. 패혈증(sepsis)
○ 감염에 의해 나타나는 전신성 염증반응 증후군으로 면역력이 약한 유아, 노인, 또는 수술 환자에 주로 급성으로 발생한다. 전 세계적으로 연간 수천만명이 발병하고 사망률이 30~60%에 이르는 질병이지만 효과적인 치료제는 아직 개발되지 않은 상태이다.
4. LBP (lipopolysaccharide-binding protein)
○ 간세포에서 주로 만들어서져 혈액에 존재하며, 내독소 덩어리와 결합하여 단분자의 내독소를 CD14로 빠르게 전달해주는 단백질
5. CD14 (Cluster of differentiation 14)
○ LBP로부터 전달받은 내독소 한 분자를 TLR4-MD2가 인지할 수 있도록 전달해주는 단백질.
6. TLR4-MD2 (Toll-like receptor 4-Myeloid differentiation factor-2)
○ 면역세포 및 주요 장기 세포막에 존재하는 세포수용체로써, 내독소와 결합하게 되면 단백질의 구조적 변화를 통해 선천성 면역반응을 활성화시키는 단백질복합체
7. 단분자 형광 기법
○ 단백질에 부착한 형광을 활용하여 단백질 각각 분자의 동적인 움직임을 작은 칩 위에서 관찰하는 최신 생물리학 기술.
8. 바이오투과전자현미경을 이용한 단백질 구조분석 (Single Particle EM)
○ 투과전자현미경 속에 정제된 단백질 샘플을 넣고 사진을 찍은 후, 컴퓨터를 활용한 이미지 프로세싱을 통해 단백질의 2차원 및 3차원 구조를 규명하는 첨단기술. 특히 이 기술은 국제 저명학술지 Nature Methods에서 2015년 올해의 기술로 선정될 정도로 전 세계 연구진의 많은 각광을 받고 있지만 국내에서는 도입기에 있음. 기존의 단백질 구조 규명 방법인 단백질결정화 방법과 다르게 적은 양의 샘플로 단백질 결정 없이 단백질의 구조를 연구할 수 있다는 장점이 있음.
그 림 설 명
(그림 1) 생체 내 박테리아 내독소 전달 메커니즘
생체 내 유입된 박테리아 내독소가 LBP 단백질에 의해 선택적으로 인식되고, 내독소 한 분자가 CD14를 거쳐 면역세포의 TLR4-MD2로 순차적으로 전달됨으로써 선천성 면역이 유도되는 분자 메커니즘을 총체적으로 규명하였음.
(상단) LBP에 의한 내독소의 인식 기작 - 그람음성균의 세포막 유래 내독소 덩어리의 표면에 막대모양의 LBP가 결합함으로써 내독소를 인식함.
(중단) LBP에 의해 내독소가 CD14로 전달되는 기작 - 내독소-LBP 복합체에 CD14가 정전기적 결합에 기반한 동적인 상호작용을 통해 반복적으로 내독소 한 분자씩을 가져감.
(하단) 내독소가 CD14에서 TLR4-MD2로 전달되는 기작 - LBP로부터 전달받은 내독소를 CD14 가 면역세포 표면에 존재하는 TLR4-MD2로 전달하고, 내독소를 전달받은 TLR4-MD2는 이합체를 형성하여 면역세포의 신호전달을 일으킴으로써 면역반응을 활성화시킴.
